諾(nuo)博萊德(de) RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(中(zhong)) 樣本裂解(jie)：多(duo)種成(cheng)分均(jun)可以(yi)從(cong)細胞(bao)中(zhong)提取(qu)總蛋白(bai)，如(ru)Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解(jie)液(ye)（中(zhong)）(RIPA Lysis Buffer)是采用壹(yi)種經典(dian)的(de)細胞(bao)組織(zhi)快(kuai)速(su)裂(lie)解並獲得總蛋白(bai)的(de)裂解液(ye)，其裂解強(qiang)度大(da)於NP-40裂(lie)解液(ye)、RIPA裂(lie)解(jie)液(弱(ruo))。所獲得(de)的(de)蛋白(bai)質可用(yong)於Western，免(mian)疫沈澱(Immunol Precipitation，IP)等。

諾(nuo)博萊德(de) RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(中(zhong))   樣本裂解(jie)產(chan)品簡介(jie)：

多種成(cheng)分均(jun)可以(yi)從(cong)細胞(bao)中(zhong)提取(qu)總蛋白(bai)，如(ru)Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解(jie)液(ye)（中(zhong)）(RIPA Lysis Buffer)是采用壹(yi)種經典(dian)的(de)細胞(bao)組織(zhi)快(kuai)速(su)裂(lie)解並獲得總蛋白(bai)的(de)裂解液(ye)，其裂解強(qiang)度大(da)於NP-40裂(lie)解液(ye)、RIPA裂(lie)解(jie)液(弱(ruo))。所獲得(de)的(de)蛋白(bai)質可用(yong)於Western，免(mian)疫沈澱(Immunol Precipitation，IP)等。

Medium RIPA Lysis Buffer主要(yao)由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等組成(cheng)，並含(han)有多(duo)種蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)成(cheng)分，可以(yi)有(you)效(xiao)抑制(zhi)蛋白(bai)的(de)降解，並(bing)維持原有的(de)蛋白(bai)間相互作(zuo)用。

產(chan)品組(zu)成(cheng)：

操(cao)作(zuo)步驟(zhou)(僅(jin)供參(can)考)：

(壹(yi))貼壁(bi)培養細胞(bao)

1.取(qu)Medium RIPA Lysis Buffer置室溫(wen)溶解混勻，加(jia)入PMSF，使PMSF終(zhong)濃度(du)為(wei)1mM。

2.去(qu)除貼壁(bi)細胞(bao)的(de)培養液，用(yong)PBS、NS或無(wu)血清培養液清洗(xi)1次(ci)，低(di)速(su)離心(xin)，棄(qi)上清，留(liu)取(qu)沈澱。

3.按照(zhao)6孔板每孔加(jia)入150～250μl含有(you)PMSF的(de)裂解液(ye)的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入Medium RIPA Lysis Buffer 。移液(ye)器(qi)輕輕吹打(da)，使裂(lie)解液(ye)和(he)細胞(bao)充(chong)分接(jie)觸。置於冰(bing)上或4℃裂解(jie)15～30min，通常裂(lie)解液(ye)作(zuo)用(yong)於細胞(bao)1～3秒(miao)內(nei)，細胞(bao)就會(hui)被裂解(jie)。通常6孔板每4.孔細胞(bao)加(jia)入100μl解液(ye)已(yi)經足(zu)夠，如(ru)果(guo)細胞(bao)密度很(hen)高(gao)可以(yi)適(shi)當(dang)加(jia)大(da)裂解(jie)液(ye)的(de)用量到(dao)200～250μl。

5.10000～12000g，4℃離心(xin)5～10min(如(ru)無(wu)低(di)溫(wen)離心(xin)機(ji)，室溫(wen)下(xia)離心(xin)亦可)，取(qu)上清。

6.進(jin)行(xing)後(hou)續(xu)的(de)SDS-PAGE、Western、免疫沈澱和免疫(yi)共(gong)沈澱等操(cao)作(zuo)。

(二)懸(xuan)浮(fu)培養細胞(bao)

1.取(qu)Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫(wen)溶解混勻，加(jia)入PMSF，使PMSF終(zhong)濃度(du)為(wei)1mM。

2.低(di)速(su)離心(xin)懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)，棄(qi)上清，收(shou)集(ji)沈澱。

3.用手指(zhi)輕彈細胞(bao)，使其(qi)松散(san)。按照(zhao)6孔板每孔細胞(bao)加(jia)入150～250μl含有(you)PMSF的(de)裂解液(ye)的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入Medium RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細胞(bao)加(jia)入150μl裂解(jie)液(ye)已(yi)經足(zu)夠，但如(ru)果(guo)細胞(bao)密度非常高(gao)可以(yi)適(shi)當(dang)加(jia)大(da)裂解(jie)液(ye)的(de)用量到(dao)200～4.250μl。再(zai)用手(shou)指輕彈以(yi)充(chong)分裂(lie)解(jie)細胞(bao)，充(chong)分裂(lie)解(jie)後應(ying)沒(mei)有(you)明顯(xian)的(de)細胞(bao)沈澱。

5.10000～12000g，4℃離心(xin)5～10min(如(ru)無(wu)低(di)溫(wen)離心(xin)機(ji)，室溫(wen)下(xia)離心(xin)亦可)，取(qu)上清。

6.進(jin)行(xing)後(hou)續(xu)的(de)SDS-PAGE、Western、免疫沈澱和免疫(yi)共(gong)沈澱等操(cao)作(zuo)。

(三(san))組(zu)織樣本

1.取(qu)Medium RIPA Lysis Buffer 置室溫(wen)溶解混勻，加(jia)入PMSF，使PMSF終(zhong)濃度(du)為(wei)1mM。

2.把組(zu)zhi剪(jian)切成(cheng)細小(xiao)的(de)碎片，越小(xiao)越好(hao)。

3.取(qu)在液氮(dan)或超低(di)溫(wen)冰(bing)箱中(zhong)冷凍30min以(yi)上(shang)的(de)組織，迅速(su)用(yong)液氮(dan)研(yan)磨(mo)，研(yan)磨(mo)過(guo)程(cheng)盡(jin)量(liang)控制(zhi)在(zai)1～2min之(zhi)內(nei)，以(yi)減(jian)少(shao)蛋白(bai)的(de)降解。

4.按照(zhao)每(mei)20mg組織加(jia)入150～250μl裂解(jie)液(ye)的(de)比(bi)例(li)加(jia)入含有(you)PMSF的(de)裂解液(ye)。冰上或4℃裂解(jie)15～30min。

5.步驟(zhou)3、4亦可以(yi)采用如(ru)下(xia)過程(cheng)：按照(zhao)每(mei)20mg組織加(jia)入150～250μl裂解(jie)液(ye)的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入含有(you)PMSF的(de)Medium RIPA Lysis Buffer。用玻璃(li)勻漿(jiang)器(qi)或組織(zhi)研(yan)磨(mo)器(qi)勻漿(jiang)，直(zhi)至(zhi)充(chong)分裂(lie)解(jie)，該過程(cheng)盡(jin)量控制(zhi)在(zai)1～2min之(zhi)內(nei)，以(yi)減(jian)少(shao)蛋白(bai)的(de)降解。

6.10000～12000g，4℃離心(xin)5～10min(如(ru)無(wu)低(di)溫(wen)離心(xin)機(ji)，室溫(wen)下(xia)離心(xin)亦可)，取(qu)上清。

7.進(jin)行(xing)後(hou)續(xu)的(de)PAGE、Western、免疫沈澱和免疫(yi)共(gong)沈澱等操(cao)作(zuo)。

諾(nuo)博萊德(de) RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(中(zhong))   樣本裂解(jie)註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)：

1.去(qu)除貼壁(bi)細胞(bao)的(de)培養液後(hou)，如(ru)果(guo)血清中(zhong)的(de)蛋白(bai)沒(mei)有(you)幹擾(rao)，可以(yi)不用清洗(xi)。

2.如(ru)果(guo)裂(lie)解(jie)不充(chong)分可以(yi)適(shi)當(dang)增(zeng)加(jia)裂解(jie)液的(de)用量，如(ru)果(guo)需要(yao)高(gao)濃度的(de)蛋白(bai)樣品，可以(yi)適(shi)當(dang)減少裂(lie)解液的(de)用量。

3.如(ru)果(guo)細胞(bao)量較(jiao)多(duo)，必(bi)需分(fen)裝(zhuang)成(cheng)50～100萬(wan)細胞(bao)/離心(xin)管(guan)，然(ran)後再(zai)裂解(jie)。大(da)團的(de)細胞(bao)較(jiao)難(nan)裂(lie)解(jie)充(chong)分，而(er)少(shao)量的(de)細胞(bao)由於裂(lie)解液(ye)容(rong)易(yi)和(he)細胞(bao)充(chong)分接(jie)觸，相對(dui)比(bi)較(jiao)容(rong)易(yi)裂(lie)解充(chong)分。

4.如(ru)果(guo)組(zu)織(zhi)樣品本身非常細小(xiao)，可以(yi)適(shi)當(dang)剪切後(hou)直(zhi)接(jie)加(jia)入裂解(jie)液(ye)裂解，通過(guo)強烈Vortex使樣品裂(lie)解充(chong)分。然(ran)後(hou)同樣離心(xin)取(qu)上清，用(yong)於後(hou)續(xu)實(shi)驗(yan)。直(zhi)接(jie)裂(lie)解的(de)優點是比(bi)較(jiao)方(fang)便(bian)，不必(bi)使用(yong)勻漿(jiang)器(qi)，缺點是不如(ru)使用(yong)勻漿(jiang)器(qi)那樣裂解得比(bi)較(jiao)充(chong)分。

5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer時，應(ying)盡量(liang)縮短溶解時間(jian)，避(bi)免(mian)有(you)效(xiao)成(cheng)分失(shi)效(xiao)。

6.裂解(jie)產(chan)物中(zhong)經常會(hui)出現壹(yi)小(xiao)團透明膠(jiao)狀(zhuang)物，屬(shu)正常現(xian)象。該透明膠(jiao)狀(zhuang)物為含(han)有基因(yin)組DNA等的(de)復(fu)合(he)物。在不檢(jian)測(ce)和(he)基因(yin)組DNA結(jie)合(he)特別緊密的(de)蛋白(bai)的(de)情況下(xia)，可以(yi)直(zhi)接(jie)離心(xin)取(qu)上清用(yong)於後(hou)續(xu)實(shi)驗(yan)；如(ru)果(guo)需要(yao)檢(jian)測(ce)和(he)基因(yin)組結(jie)合(he)特別緊密的(de)蛋白(bai)，7.則可以(yi)通過(guo)超聲(sheng)處理打(da)碎打(da)散該透明膠(jiao)狀(zhuang)物，隨後離心(xin)取(qu)上清用(yong)於後(hou)續(xu)實(shi)驗(yan)。如(ru)果(guo)檢(jian)測(ce)壹(yi)些(xie)常見(jian)的(de)轉錄(lu)因(yin)子(zi)，例如(ru)NF-KB、p53等時，通常不必(bi)進(jin)行(xing)超(chao)聲(sheng)處理，就(jiu)可以(yi)檢(jian)測(ce)到(dao)這些轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子(zi)。

8.細胞(bao)裂解(jie)的(de)操(cao)作(zuo)步驟(zhou)，應(ying)置於冰(bing)上或4℃進(jin)行(xing)。

有(you)效(xiao)期： 12個(ge)月(yue)有(you)效(xiao)。