本制(zhi)品使用通(tong)過基(ji)因(yin)重(zhong)組技術(shu)克隆(long)表達的(de)點(dian)突(tu)變(bian)型RNase H活性缺失(shi)的 M-MuLV反轉(zhuan)錄酶(mei)。野生(sheng)型的M-MuLV 包含的(de)RNase H活性能夠(gou)催(cui)化(hua)降解(jie)DNA/RNA雜合(he)體(ti)中(zhong)的(de)RNA，因(yin)此(ci)在cDNA第壹(yi)條鏈(lian)的合(he)成(cheng)反應(ying)中(zhong)可能會(hui)降(jiang)解(jie)RNA/DNA雜(za)合(he)體(ti)中(zhong)的(de)模(mo)板(ban)RNA。
M-MuLV Reverse Transcriptase反轉(zhuan)錄試(shi)劑

諾(nuo)博萊(lai)德 M-MuLV Reverse Transcriptase反轉(zhuan)錄試(shi)劑

Script III M-MuLV Reverse Transcriptase

目錄號(hao)：71117

產品內(nei)容

保存條件：-20℃保存，有效期(qi) 12 個(ge)月(yue)

具體產(chan)品的參(can)數以收到產(chan)品說明書的(de)參(can)數為準

產品簡(jian)介

本制品使用通(tong)過基(ji)因(yin)重(zhong)組技術(shu)克隆(long)表達的(de)點(dian)突(tu)變(bian)型RNase H活性缺失(shi)的 M-MuLV反轉(zhuan)錄酶(mei)。野生(sheng)型的M-MuLV 包含的(de)RNase H活性能夠(gou)催(cui)化(hua)降解(jie)DNA/RNA雜合(he)體(ti)中(zhong)的(de)RNA，因(yin)此(ci)在cDNA第壹(yi)條鏈(lian)的合(he)成(cheng)反應(ying)中(zhong)可能會(hui)降(jiang)解(jie)RNA/DNA雜(za)合(he)體(ti)中(zhong)的(de)模(mo)板(ban)RNA。本(ben)酶(mei)M-MuLV(RNase Hˉ)的(de)RNase H活性缺失(shi)，與(yu)M-MuLV 相比，具(ju)有(you)更(geng)強(qiang)的(de)延(yan)伸(shen)能力和(he)穩定(ding)性(xing)，可用於較長的(de)cDNA合(he)成(cheng)以及高(gao)比例(li)的(de)全長cDNA文庫的構建(jian)等(deng)。

適用範(fan)圍

第壹鏈(lian)cDNA合(he)成(cheng)。可用於低拷(kao)貝基(ji)因(yin)的(de)檢測。

產品特點(dian)

合(he)成(cheng)cDNA片(pian)段(duan)長(chang)度最高可達(da)12 kb。

引物的(de)選擇：

1. 如果RNA模(mo)板(ban)來(lai)源於真核(he)生(sheng)物，首xuanOligo (dT)，與(yu)真核(he)生(sheng)物mRNA的 3’PolyA尾配(pei)對，可獲(huo)得最高產(chan)量(liang)的(de)全長cDNA。

2. 如果對(dui)壹些物種(zhong)，不能確定mRNA是否有polyA尾的(de)情況(kuang)下，首xuanOligo (dT)，不(bu)成(cheng)功再嘗(chang)試(shi)基(ji)因(yin)特異(yi)性引物(GSP)和Random primer為引(yin)物。

3. 基(ji)因(yin)特異(yi)性引物(GSP)的特異(yi)性較高。但有些(xie)情(qing)況(kuang)下，用於PCR反應(ying)的GSP無(wu)法(fa)有效引導第壹(yi)鏈cDNA合(he)成(cheng)，可改(gai)用Oligo (dT)或(huo)Random primer重(zhong)新(xin)進(jin)行(xing)逆轉(zhuan)錄。

4. Random primer特異(yi)性最di，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均(jun)可以作為Random primer的(de)模板(ban)。當目標區域具有(you)復(fu)雜(za)二級結(jie)構或(huo)GC含量(liang)較(jiao)高，或(huo)者(zhe)模(mo)板(ban)為原(yuan)核(he)生(sheng)物來源，使用Oligo (dT)或(huo)基(ji)因(yin)特異(yi)性引物(GSP)無法(fa)有效引導cDNA合(he)成(cheng)時，可使(shi)用Random primer為引(yin)物。

5. 如果合(he)成(cheng)cDNA下遊用於qPCR，可將(jiang)Oligo (dT)與(yu)Random primer混合(he)使(shi)用（各(ge)加(jia)1μl /20μl反應(ying)體系(xi)），可使(shi)mRNA的各(ge)個(ge)區域cDNA合(he)成(cheng)效(xiao)率相同，有(you)助於(yu)提(ti)高(gao)qPCR結果的真實(shi)性(xing)和(he)重(zhong)復(fu)性(xing)。

第壹連(lian) cDNA 合(he)成(cheng) (以 20 μl 反應(ying)體系(xi)為例(li))

1.反應(ying)體系(xi)的(de)配(pei)制

操(cao)作前，請將(jiang)各(ge)組分輕(qing)彈(dan)混勻(yun)，點(dian)甩離心(xin)收(shou)集(ji)至(zhi)管底(di)，置(zhi)冰上備用。

使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制(zhi)：

2．輕柔(rou)吸(xi)打(da)混勻(yun)，點(dian)甩離心(xin)，置(zhi) PCR 儀(yi)進(jin)行(xing)逆轉(zhuan)錄反應(ying)。

如用Oligo(dT)18或(huo)基(ji)因(yin)特異(yi)性引物(GSP)，產物用於PCR：42℃孵育(yu)30 min；產物用於qPCR：42℃孵育(yu)15 min。

如用 Random Primer,25℃孵育(yu)10 min後，產(chan)物用於PCR，42℃孵育(yu)30 min；25℃孵育(yu) 10 min 後，產(chan)物用於 qPCR，42℃孵育(yu) 15 min。

註意(yi)：如果(guo)模板(ban)具(ju)有(you)復(fu)雜(za)二級結(jie)構或(huo)高(gao) GC 區域，可以先只加(jia) RNA模(mo)板(ban)、引(yin)物(wu)和(he) RNase free H2O，混勻(yun)，65℃變(bian)性 5 min，冰上冷(leng)卻(que)，點(dian)甩離心(xin)後(hou)加(jia)入(ru)其(qi)它成分，並將(jiang) 42℃孵育(yu)溫度(du)提升(sheng)至(zhi) 50°C，有助(zhu)於提高產量(liang)。

3． 85°C加熱 5 sec，失(shi)活RTase和dsDNase，終止(zhi)反應(ying)。

逆轉(zhuan)錄產物(wu)可立(li)即用於PCR或(huo)qPCR反應(ying)，或(huo)保存於-20°C，並在半(ban)年內(nei)使用；長期存放(fang)建(jian)議(yi)分裝(zhuang)後在-70°C保存，cDNA應(ying)避免(mian)反復(fu)凍融(rong)。

PCR

建(jian)議(yi)取2 - 4 μl的(de)cDNA產物原(yuan)液(ye)作為PCR模(mo)板(ban)。

1. 常規擴(kuo)增(zeng)：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)

71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)

2. 高保真擴增(zeng)：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片(pian)段(duan))

71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片(pian)段(duan))

qPCR

建(jian)議(yi)取1~2μl cDNA產(chan)物原(yuan)液(ye)作為20μl qPCR反應(ying)體系(xi)的(de)模(mo)板(ban)。如(ru)果(guo)基(ji)因(yin)表

達量(liang)較(jiao)高，請根(gen)據實(shi)際(ji)情(qing)況(kuang)適當稀釋cDNA模(mo)板(ban)後(hou)使(shi)用。

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