本(ben)制(zhi)品使用通過(guo)基因(yin)重(zhong)組技術克(ke)隆(long)表達(da)的(de)點突變(bian)型RNase H活(huo)性缺失(shi)的(de)M-MuLV反轉(zhuan)錄(lu)酶Script Hˉ Rtase， 同(tong)時經過(guo)多點(dian)突變(bian)，獲(huo)得的(de)能高(gao)達(da)60℃的(de)第四(si)代反轉錄(lu)酶（Script IV M-MuLV），在50-60℃均有(you)較(jiao)好(hao)的(de)反轉(zhuan)錄(lu)效果(guo)，同時大大(da)的(de)提(ti)高(gao)了(le)GC含量(liang)高(gao)，二(er)級(ji)結(jie)構(gou)豐(feng)富的(de)RNA模板的(de)反轉(zhuan)錄(lu)效率(lv)。
M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉錄(lu)試劑(ji)

 諾(nuo)博萊(lai)德(de) M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuan)錄(lu)試劑(ji)

Script IV M-MuLV Reverse Transcriptase

目錄(lu)號：71413

產(chan)品內(nei)容

保(bao)存條(tiao)件(jian)：-20℃保(bao)存，有(you)效期(qi) 12 個月(yue)。

具(ju)體(ti)產(chan)品的(de)參數以(yi)收(shou)到產品說明(ming)書的(de)參數為(wei)準

產(chan)品簡介

本(ben)制(zhi)品使用通過(guo)基因(yin)重(zhong)組技術克(ke)隆(long)表達(da)的(de)點突變(bian)型RNase H活(huo)性缺失(shi)的(de)M-MuLV反轉(zhuan)錄(lu)酶Script Hˉ Rtase， 同(tong)時經過(guo)多點(dian)突變(bian)，獲(huo)得的(de)能高(gao)達(da)60℃的(de)第四(si)代反轉錄(lu)酶（Script IV M-MuLV），在50-60℃均有(you)較(jiao)好(hao)的(de)反轉(zhuan)錄(lu)效果(guo)，同時大大(da)的(de)提(ti)高(gao)了(le)GC含量(liang)高(gao)，二(er)級(ji)結(jie)構(gou)豐(feng)富的(de)RNA模板的(de)反轉(zhuan)錄(lu)效率(lv)。野(ye)生型的(de)M-MuLV 包(bao)含的(de)RNase H活性(xing)能夠(gou)催(cui)化降解DNA/RNA雜合(he)體(ti)中(zhong)的(de)RNA，因此(ci)在cDNA第壹條(tiao)鏈(lian)的(de)合(he)成反(fan)應中可能(neng)會降(jiang)解RNA/DNA雜合(he)體(ti)中(zhong)的(de)模板RNA。Script IV M-MuLV (RNase Hˉ)的(de)RNase H活性(xing)缺失(shi)，與(yu)MMuLV 相比(bi)，具有(you)更(geng)強的(de)延伸(shen)能力(li)和穩定(ding)性(xing)，可用於較(jiao)長(chang)的(de)cDNA合(he)成以(yi)及(ji)高(gao)比(bi)例(li)的(de)全(quan)長(chang)cDNA文(wen)庫的(de)構建(jian)等(deng)。

適(shi)用範(fan)圍

第(di)壹鏈(lian)cDNA合(he)成。可(ke)用於低(di)拷(kao)貝(bei)基(ji)因(yin)的(de)檢測。

產(chan)品特點

合(he)成cDNA片(pian)段長(chang)度(du)最(zui)高(gao)可(ke)達(da)15 kb。

引物的(de)選(xuan)擇：

1. 如(ru)果(guo)RNA模板來源於真核生物，首xuanOligo (dT)，與(yu)真核生物mRNA的(de)3’PolyA尾配對(dui)，可(ke)獲得最(zui)高(gao)產(chan)量(liang)的(de)全(quan)長(chang)cDNA。

2. 如(ru)果(guo)對(dui)壹些(xie)物種，不(bu)能(neng)確(que)定(ding)mRNA是否有(you)polyA尾(wei)的(de)情(qing)況下，首xuanOligo(dT)，不(bu)成(cheng)功再嘗(chang)試基因(yin)特異(yi)性(xing)引物(GSP)和Random primer為(wei)引物。

3. 基(ji)因特異(yi)性(xing)引物(GSP)的(de)特異(yi)性(xing)較(jiao)高(gao)。但(dan)有(you)些(xie)情(qing)況下，用於PCR反(fan)應(ying)的(de)GSP無法(fa)有(you)效引導(dao)第(di)壹鏈(lian)cDNA合(he)成，可(ke)改用Oligo (dT)或(huo)Randomprimer重(zhong)新(xin)進行(xing)逆轉(zhuan)錄(lu)。

4. Random primer特異(yi)性(xing)最(zui)di，所(suo)有(you)RNA，包(bao)括(kuo)mRNA，rRNA，tRNA均可以(yi)作(zuo)為(wei)Random primer的(de)模板。當(dang)目標區(qu)域(yu)具有(you)復雜二級結(jie)構(gou)或(huo)GC含(han)量(liang)較(jiao)高(gao)，或(huo)者(zhe)模板為(wei)原核(he)生物來源，使用Oligo (dT)或(huo)基(ji)因(yin)特異(yi)性(xing)引物(GSP)無法(fa)有(you)效引導(dao)cDNA合(he)成時，可使(shi)用Random primer為(wei)引物。

5. 如(ru)果(guo)合(he)成cDNA下遊用於qPCR，可(ke)將Oligo (dT)與(yu)Random primer混(hun)合(he)使用（各加1μl /20μl反應(ying)體(ti)系(xi)），可使(shi)mRNA的(de)各個(ge)區域(yu)cDNA合(he)成效率(lv)相同，有(you)助(zhu)於提(ti)高(gao)qPCR結(jie)果(guo)的(de)真實性(xing)和重復性(xing)。

第(di)壹連(lian) cDNA 合(he)成 (以(yi) 20 μl 反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)為(wei)例)

1．反(fan)應體(ti)系(xi)的(de)配制(zhi)

操作(zuo)前，請將各組分輕(qing)彈混(hun)勻(yun)，點甩(shuai)離(li)心收(shou)集(ji)至(zhi)管(guan)底(di)，置冰(bing)上(shang)備(bei)用。

使(shi)用 RNase-Free PCR 管(guan)在冰上(shang)配制(zhi)：

2．輕(qing)柔(rou)吸(xi)打混(hun)勻(yun)，點甩(shuai)離(li)心，置 PCR 儀進行(xing)逆轉(zhuan)錄(lu)反(fan)應(ying)。

如(ru)用Oligo(dT)18或(huo)基(ji)因(yin)特異(yi)性(xing)引物(GSP)，產物用於PCR：50℃孵育30 min；產(chan)物用於qPCR：50℃孵育15 min。

如(ru)用 Random Primer,25℃孵育10 min 後，產(chan)物用於 PCR，50℃孵育30 min；25℃孵育 10 min 後，產(chan)物用於 qPCR，50℃孵育 15 min。

註意(yi)：如(ru)果(guo)模板具(ju)有(you)復雜二級結(jie)構(gou)或(huo)高(gao) GC 區(qu)域(yu)，可以(yi)先(xian)只(zhi)加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O，混(hun)勻(yun)，65℃變性 5 min，冰上(shang)冷(leng)卻，點(dian)甩(shuai)離(li)心後加入其它(ta)成(cheng)分，並將 50℃孵育溫度(du)提(ti)升(sheng)至(zhi) 55°C，有(you)助(zhu)於提(ti)高(gao)產(chan)量(liang)。

3． 85°C加熱 5 sec，失活RTase和dsDNase，終止反(fan)應(ying)。

逆(ni)轉錄(lu)產(chan)物可立(li)即用於PCR或(huo)qPCR反(fan)應(ying)，或(huo)保(bao)存於-20°C，並在半(ban)年內(nei)使用；長(chang)期(qi)存放建(jian)議(yi)分裝(zhuang)後(hou)在-70°C保存，cDNA應避(bi)免反復凍(dong)融(rong)。

PCR

建(jian)議(yi)取(qu)2 - 4 μl的(de)cDNA產物原液(ye)作(zuo)為(wei)PCR模板。

1. 常(chang)規擴(kuo)增(zeng)：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)

71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)

2. 高(gao)保(bao)真擴增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段(duan))

71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片(pian)段)

qPCR

建(jian)議(yi)取(qu)1~2μl cDNA產物原液(ye)作(zuo)為(wei)20μl qPCR反應(ying)體(ti)系(xi)的(de)模板。如(ru)果(guo)基因(yin)表

達(da)量(liang)較(jiao)高(gao)，請根(gen)據(ju)實際(ji)情(qing)況適(shi)當(dang)稀(xi)釋cDNA模板後(hou)使用。

相(xiang)關產(chan)品：

71519 2x SYBR Green qPCR Mix (同(tong)TB Green Premix Ex Taq)

71600 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適(shi)用於所(suo)有(you)qPCR儀)

91011 RNAzol Reagent（Trizol）

91013 通用型總(zong)RNA快速提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)（動物、植物、細菌、真菌、酵(jiao)母(mu)）

91218 動(dong)物組織/細胞(bao)/昆蟲(chong)總RNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he) (同RNeasy Plus Mini Kit)

91318 多(duo)糖多(duo)酚(fen)植物總RNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)（RNeasy Plant Mini Kit的(de)升(sheng)級(ji)版(ban))

91451 高(gao)效動(dong)物組織/細胞(bao)總RNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he) (動物組織、細胞(bao))

91452 高(gao)效植物總RNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)（根、莖(jing)、葉、花(hua)）

 M-MuLV Reverse Transcriptase 反(fan)轉錄(lu)試劑(ji)