多(duo)種(zhong)成分(fen)均可(ke)以從(cong)細胞中提(ti)取(qu)總蛋白。NP-40 裂(lie)解(jie)液(ye)(NP-40 Lysis Buffer)是采用壹(yi)種(zhong)溫和的裂解(jie)方(fang)法(fa)獲得(de)總蛋白的裂解(jie)液(ye)。所獲得(de)的蛋白質(zhi)可以用於(yu) PAGE 電泳、 Western、免(mian)疫(yi)沈澱(dian)和免(mian)疫(yi)共沈澱(dian)(co-IP)等，並含(han)有(you)多種(zhong)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)成分(fen)，可有(you)效抑(yi)制蛋白的降(jiang)解，並(bing)維持(chi)原有(you)的蛋白間(jian)相(xiang)互(hu)作(zuo)用。
諾(nuo)博萊德 NP-40裂解(jie)液(ye) 樣本裂解采集與制(zhi)備(bei)

諾(nuo)博萊德 NP-40裂解(jie)液(ye) 樣本裂解采集與制(zhi)備(bei)

產(chan)品簡介(jie)：

多種(zhong)成分(fen)均可(ke)以從(cong)細胞中提(ti)取(qu)總蛋白，如 Triton、SDS、NP-40 等。NP-40 裂解(jie)液(ye)(NP-40 Lysis Buffer)是采用壹(yi)種(zhong)溫和的裂解(jie)方(fang)法(fa)獲得(de)總蛋白的裂解(jie)液(ye)。所獲得(de)的蛋白質(zhi)可以用於(yu) PAGE 電泳、 Western、免(mian)疫(yi)沈澱(dian)(Immunol Precipitation ， IP)和免(mian)疫(yi)共沈澱(dian)(co-IP)等，並含(han)有(you)多種(zhong)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)成分(fen)，可有(you)效抑(yi)制蛋白的降(jiang)解，並(bing)維持(chi)原有(you)的蛋白間(jian)相(xiang)互(hu)作(zuo)用。

NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 主要(yao)由 Tris-HCl、NaCl、NP-40 以及 sodium pyropho-sphate，β-glycerophosphate，sodium  fluoride,  EDTA 等多種(zhong)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)組(zu)成。用NP-40  Lysis  Buffer 得(de)到(dao)的蛋白，可(ke)以用 BCA 蛋白定(ding)量(liang)試劑(ji)盒和(he) Bradford 蛋白定(ding)量(liang)試劑(ji)盒測定蛋白濃(nong)度。 

產(chan)品組(zu)成：

諾(nuo)博萊德 NP-40裂解(jie)液(ye) 樣本裂解采集與制(zhi)備(bei)

操作步(bu)驟(zhou)(僅(jin)供(gong)參考(kao))：

(壹(yi))貼(tie)壁培養(yang)細(xi)胞

1、取 NP-40 Lysis Buffer  置於(yu)室(shi)溫溶解(jie)混(hun)勻(yun)，加(jia)入 PMSF，使(shi) PMSF 終濃(nong)度為 1mM。

2、去除貼(tie)壁細胞的培養(yang)液(ye)，用 PBS、NS 或(huo)無(wu)血清培養(yang)液(ye)清洗 1 次，低(di)速(su)離(li)心(xin)，棄(qi)上清，留(liu)取(qu)沈澱(dian)。

3、按照(zhao) 6 孔(kong)板每(mei)孔(kong)加(jia)入 150～250μl 含(han)有(you) PMSF 的裂解(jie)液(ye)的比例(li)，加(jia)入 NP-40  Lysis Buffer。移液(ye)器輕(qing)輕(qing)吹(chui)打(da)，使(shi)裂(lie)解液(ye)和細胞充(chong)分(fen)接觸(chu)。置於(yu)冰上或 4℃裂解 15～30min，通(tong)常裂(lie)解(jie)液(ye)作用於(yu)細胞 1～3s內，細胞就(jiu)會被裂解。

4、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無(wu)低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機，室(shi)溫下(xia)離心(xin)亦可)，取(qu)上清。

5、進(jin)行後(hou)續(xu)的 SDS-PAGE、Western、免(mian)疫(yi)沈澱(dian)和免(mian)疫(yi)共沈澱(dian)等操作(zuo)。

(二)懸浮培養(yang)細(xi)胞

1、取 NP-40  Lysis  Buffer  置於(yu)室(shi)溫溶解(jie)混(hun)勻(yun)，加(jia)入 PMSF，使(shi) PMSF 終濃(nong)度為 1mM。低(di)速(su)離(li)心(xin)懸浮細胞，棄(qi)上清，收集沈澱(dian)。

2、用手(shou)指(zhi)輕(qing)彈細胞，使(shi)其松散(san)。按(an)照(zhao) 6 孔(kong)板每(mei)孔(kong)細胞加(jia)入 150～200μl 含(han)有(you) PMSF 的裂解(jie)液(ye)的比例(li)，加(jia)入 NP-40 Lysis Buffer  。通(tong)常 6 孔(kong)板每(mei)孔(kong)細胞加(jia)入 150μl 裂(lie)解(jie)液(ye)已經足夠(gou)，但如果(guo)細胞密度非(fei)常高(gao)可以適當(dang)加(jia)大裂(lie)解(jie)液(ye)的用量(liang)到(dao) 200～250μl。再用手(shou)指(zhi)輕(qing)彈以充(chong)分(fen)裂解(jie)細(xi)胞，充(chong)分(fen)裂解(jie)後(hou)應沒(mei)有(you)明顯的細胞沈澱(dian)。

3、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無(wu)低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機，室(shi)溫下(xia)離心(xin)亦可)，取(qu)上清。

4、進(jin)行後(hou)續(xu)的 SDS-PAGE、Western、免(mian)疫(yi)沈澱(dian)和免(mian)疫(yi)共沈澱(dian)等操作(zuo)。

(三)組(zu)織樣本

1、取 NP-40  Lysis  Buffer  置於(yu)室(shi)溫溶解(jie)混(hun)勻(yun)，加(jia)入 PMSF，使(shi) PMSF 終濃(nong)度為 1mm。把組(zu)zhi剪(jian)切成細(xi)小(xiao)的碎片(pian)，越(yue)小(xiao)越(yue)好(hao)。

  2、取在(zai)液(ye)氮或(huo)超低(di)溫(wen)冰(bing)箱(xiang)中冷凍(dong) 30min 以上的組(zu)織，迅(xun)速(su)用液(ye)氮研磨(mo)，研磨(mo)過程盡(jin)量(liang)控

制在(zai) 1～2min 之內(nei)，以減少(shao)蛋白的降(jiang)解。

3、按照(zhao)每 20mg 組(zu)織加(jia)入 150～250μl 裂(lie)解(jie)液(ye)的比例(li)加(jia)入含(han)有(you) PMSF 的裂解(jie)液(ye)。冰上或 4℃裂解 30～60min。

4、 步驟(zhou) 3、4 亦(yi)可(ke)以采用如下(xia)過程：按(an)照(zhao)每 20mg 組(zu)織加(jia)入 150～250μl 裂(lie)解(jie)液(ye)的比例(li)，加(jia)入含(han)有(you) PMSF 的 NP-40 Lysis Buffer。用玻(bo)璃勻(yun)漿(jiang)器或組(zu)織研磨(mo)器勻(yun)漿(jiang)，直至(zhi)充(chong)分(fen)裂解(jie)，該(gai)過程盡(jin)量(liang)控制(zhi)在(zai) 1～2min 之內(nei)，以減少(shao)蛋白的降(jiang)解。

  5、10000～12000g，4℃離心 5～15min(如無(wu)低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機，室(shi)溫下(xia)離心(xin)亦可)，取(qu)上清。

  6、進(jin)行後(hou)續(xu)的 PAGE、Western、免(mian)疫(yi)沈澱(dian)和免(mian)疫(yi)共沈澱(dian)等操作(zuo)。

註意(yi)事(shi)項(xiang)：

1、在(zai)貼(tie)壁培養(yang)細(xi)胞的操作(zuo)步驟(zhou)中，去(qu)除貼(tie)壁細胞的培養(yang)液(ye)後，如果(guo)血清中的蛋白沒(mei)有(you)幹擾，可(ke)以不(bu)用清洗。

2、如果(guo)裂解不(bu)充(chong)分(fen)可以適當(dang)增加(jia)裂解(jie)液(ye)的用量(liang)，如果(guo)需要(yao)高(gao)濃(nong)度的蛋白樣(yang)品(pin)，可(ke)以適當(dang)減少(shao)裂解(jie)液(ye)的用量(liang)。

3、在(zai)培養(yang)細(xi)胞的裂解(jie)中，如果(guo)細胞量較多，必需分(fen)裝成 50～100 萬細胞/離心管(guan)，然後(hou)再裂解(jie)。大團(tuan)的細胞較難裂(lie)解(jie)充(chong)分(fen)，而少(shao)量的細胞由於(yu)裂解液(ye)容(rong)易和(he)細胞充(chong)分(fen)接觸(chu)，相對(dui)比較(jiao)容(rong)易裂(lie)解充(chong)分(fen)。

4、 如果(guo)組(zu)織樣品本身非(fei)常細(xi)小(xiao)，可以適當(dang)剪(jian)切後(hou)直接(jie)加(jia)入裂(lie)解(jie)液(ye)裂解，通(tong)過強烈 Vortex使(shi)樣(yang)品裂解充(chong)分(fen)。然後(hou)同樣(yang)離(li)心取上清，用於(yu)後續(xu)實驗(yan)。直接(jie)裂解的優點是比較(jiao)方(fang)便，不(bu)必使(shi)用勻(yun)漿(jiang)器，缺點是不(bu)如使(shi)用勻(yun)漿(jiang)器那樣裂(lie)解(jie)得(de)比較(jiao)充(chong)分(fen)。

  5、溶解(jie) NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 時(shi)，應盡量(liang)縮(suo)短(duan)溶解(jie)時(shi)間，避(bi)免(mian)裂(lie)解液(ye)中的有(you)效成分(fen)失(shi)效。

6、細胞裂解的操作(zuo)步驟(zhou)，應置於(yu)冰上或 4℃進(jin)行。

7、為了(le)您的安全(quan)和健康，請穿(chuan)實驗(yan)服(fu)並戴(dai)壹(yi)次性手(shou)套操作(zuo)。

有(you)效期：12個月有(you)效。