多(duo)種(zhong)成(cheng)分(fen)均(jun)可(ke)從(cong)細(xi)胞(bao)中(zhong)提取(qu)總(zong)蛋(dan)白，如Triton、SDS、NP-40等(deng)。RIPA裂(lie)解液(弱(ruo)) (Weak RIPA Lysis Buffer )是(shi)采(cai)用壹種(zhong)溫(wen)和(he)的裂(lie)解方法獲(huo)得(de)總蛋白的(de)裂(lie)解液。所(suo)獲(huo)得(de)的蛋白質(zhi)可(ke)用於PAGE電泳(yong)、Western、免疫(yi)沈澱(dian)(Immunol Precipitation，IP)和(he)免疫(yi)共沈澱(dian)(co-IP)等(deng)。
諾(nuo)博(bo)萊德(de) RIPA裂(lie)解液(弱(ruo)) 樣(yang)本(ben)裂(lie)解采(cai)集(ji)

諾博(bo)萊德(de) RIPA裂(lie)解液(弱(ruo)) 樣(yang)本(ben)裂(lie)解采(cai)集(ji)

產品(pin)簡介(jie)：

多(duo)種(zhong)成(cheng)分(fen)均(jun)可(ke)從(cong)細(xi)胞(bao)中(zhong)提取(qu)總(zong)蛋(dan)白，如Triton、SDS、NP-40等(deng)。RIPA裂(lie)解液(弱(ruo)) (Weak RIPA Lysis Buffer )是(shi)采(cai)用壹種(zhong)溫(wen)和(he)的裂(lie)解方法獲(huo)得(de)總蛋白的(de)裂(lie)解液。所(suo)獲(huo)得(de)的蛋白質(zhi)可(ke)用於PAGE電泳(yong)、Western、免疫(yi)沈澱(dian)(Immunol Precipitation，IP)和(he)免疫(yi)共沈澱(dian)(co-IP)等(deng)。

NobleRyder Weak RIPA Lysis Buffer主要(yao)由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等(deng)組(zu)成(cheng)，並(bing)含(han)有多(duo)種(zhong)蛋(dan)白酶抑(yi)制(zhi)劑成(cheng)分(fen)，可(ke)以有效(xiao)抑(yi)制(zhi)蛋白(bai)的降解，並(bing)維持原(yuan)有的(de)蛋(dan)白間(jian)相互(hu)作用。

產品(pin)組(zu)成(cheng)：

諾博(bo)萊德(de) RIPA裂(lie)解液(弱(ruo)) 樣(yang)本(ben)裂(lie)解采(cai)集(ji)

操作(zuo)步驟(僅供(gong)參考(kao))：

(壹)貼壁培養細(xi)胞(bao)

1.取(qu)Weak RIPA Lysis Buffer置(zhi)於室溫(wen)溶(rong)解混勻(yun)，加(jia)入(ru)PMSF，使PMSF終(zhong)濃(nong)度為(wei)1mM。

2.去除(chu)貼壁細胞(bao)的培養液，用PBS、NS或(huo)無血清培養液清洗(xi)1次，低(di)速(su)離(li)心，棄上清，留取(qu)沈澱(dian)。

3.按照(zhao)6孔板每孔(kong)加(jia)入(ru)150～250μl含(han)有PMSF的(de)裂(lie)解液的(de)比(bi)例(li)， 加(jia)入(ru)Weak RIPA Lysis Buffer。移液器(qi)輕(qing)輕(qing)吹(chui)打(da)，使裂(lie)解液和(he)細胞(bao)充(chong)分(fen)接(jie)觸(chu)。置(zhi)於冰上或(huo)4℃裂解，通(tong)常裂解液作(zuo)用於細胞(bao)1～3s內(nei)，細(xi)胞(bao)就(jiu)會被(bei)裂解。通(tong)常6孔板(ban)每孔(kong)細胞(bao)加(jia)入(ru)150μl裂(lie)解液已(yi)經足(zu)夠(gou)，但(dan)如果(guo)細胞(bao)密度非常高(gao)可以適當加(jia)大裂解液的(de)用量到200～250μl。

4.10000～12000g，4℃離心(xin)5～10min(如無低(di)溫(wen)離(li)心機，室溫(wen)下(xia)離心(xin)亦(yi)可)，取(qu)上(shang)清。

5.後續(xu)的SDS-PAGE、Western、免(mian)疫沈澱(dian)和(he)免疫(yi)共沈澱(dian)等(deng)操(cao)作。

(二)懸(xuan)浮(fu)培(pei)養細(xi)胞(bao)

1.取(qu)Weak RIPA Lysis Buffer 置(zhi)室溫(wen)溶(rong)解混勻(yun)後(hou)，加(jia)入(ru)PMSF，使PMSF終(zhong)濃(nong)度為(wei)1mM。

2.低(di)速(su)離(li)心懸浮(fu)細(xi)胞(bao)，棄上清，收集(ji)沈澱(dian)。

3.用手指(zhi)輕(qing)彈細胞(bao)，使其(qi)松(song)散(san)。按(an)照(zhao)6孔板每孔(kong)細胞(bao)加(jia)入(ru)150～250μl含(han)有PMSF的(de)裂(lie)解液的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入(ru)Weak RIPA Lysis Buffer 。通(tong)常6孔板(ban)每孔(kong)細胞(bao)加(jia)入(ru)150μl裂(lie)解液已(yi)經足(zu)夠(gou)，但(dan)如果(guo)細胞(bao)密度非常高(gao)可以適當加(jia)大裂解液的(de)用量到200～250μl。再(zai)用手指(zhi)輕(qing)彈以充(chong)分(fen)裂(lie)解細(xi)胞(bao)，充(chong)分(fen)裂(lie)解後(hou)應沒有明顯(xian)的(de)細(xi)胞(bao)沈澱(dian)。

4.10000～12000g，4℃離心(xin)5～10min(如無低(di)溫(wen)離(li)心機，室溫(wen)下(xia)離心(xin)亦(yi)可)，取(qu)上(shang)清。

5.進行(xing)後(hou)續的(de)SDS-PAGE、Western、免(mian)疫沈澱(dian)和(he)免疫(yi)共沈澱(dian)等(deng)操(cao)作。

(三)組(zu)織樣(yang)本(ben)

1.取(qu)Weak RIPA Lysis Buffer置(zhi)於室溫(wen)溶(rong)解混勻(yun)後(hou)，加(jia)入(ru)PMSF，使PMSF終(zhong)濃(nong)度為(wei)1mM。

2.把組(zu)zhi剪(jian)切(qie)成(cheng)細(xi)小(xiao)的碎片(pian)，越(yue)小(xiao)越(yue)好。

3.取(qu)在液氮(dan)或(huo)超低(di)溫(wen)冰箱中(zhong)冷(leng)凍30min以上的組(zu)織，迅(xun)速(su)用液氮(dan)研磨，研磨過程(cheng)盡量控制(zhi)在1～2min之(zhi)內(nei)，以減少(shao)蛋白(bai)的(de)降(jiang)解。

4.按照(zhao)每20mg組(zu)織加(jia)入(ru)150～250μl裂(lie)解液的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入(ru)含(han)有PMSF的(de)裂(lie)解液。冰上或(huo)4℃裂解15～30min。

步驟3、4亦(yi)可以采用如下過程(cheng)：按照(zhao)每20mg組(zu)織加(jia)入(ru)150～250μl裂(lie)解液的(de)比(bi)例(li)加(jia)入(ru)含(han)有PMSF的(de)Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器(qi)或(huo)組(zu)織研磨器(qi)勻(yun)漿，直至(zhi)充(chong)分(fen)裂(lie)解，該(gai)過程(cheng)盡量控制(zhi)在1～2min之(zhi)內(nei)，以減少(shao)蛋白(bai)的(de)降(jiang)解。

5.10000～12000g，4℃離心(xin)5～10min(如無低(di)溫(wen)離(li)心機，室溫(wen)下(xia)離心(xin)亦(yi)可)，取(qu)上(shang)清。

6.進行(xing)後(hou)續的(de)PAGE、Western、免(mian)疫沈澱(dian)和(he)免疫(yi)共沈澱(dian)等(deng)操(cao)作。

註意(yi)事項(xiang)：

1.去除(chu)貼壁細胞(bao)的培養液後(hou)，如果(guo)血清中(zhong)的蛋(dan)白沒(mei)有幹擾，可以不(bu)用清洗(xi)。

2.如果(guo)裂解不(bu)充(chong)分(fen)可(ke)以適當增(zeng)加(jia)裂(lie)解液的(de)用量，如果(guo)需要高(gao)濃度的(de)蛋白樣(yang)品，可(ke)以適當減少(shao)裂解液的(de)用量。

3.如果(guo)細胞(bao)量較(jiao)多(duo)，必需分(fen)裝(zhuang)成(cheng)50～100萬(wan)細(xi)胞(bao)/離心管，然後再(zai)裂解。大團的(de)細胞(bao)較(jiao)難裂(lie)解充(chong)分(fen)，而(er)少(shao)量的細(xi)胞(bao)由於裂解液容(rong)易和(he)細胞(bao)充(chong)分(fen)接(jie)觸(chu)，相對比(bi)較(jiao)容(rong)易裂(lie)解充(chong)分(fen)。

4.如果(guo)組(zu)織樣(yang)品本(ben)身非常細小(xiao)，可以適當剪(jian)切(qie)後直接(jie)加(jia)入(ru)裂(lie)解液裂(lie)解，通(tong)過強烈(lie)Vortex使樣(yang)品裂(lie)解充(chong)分(fen)。然(ran)後(hou)同樣(yang)離心(xin)取(qu)上(shang)清，用於後續實驗。直(zhi)接(jie)裂解的(de)優(you)點是(shi)比(bi)較(jiao)方便，不(bu)必使用勻漿(jiang)器(qi)，缺點(dian)是(shi)不(bu)如使用勻漿(jiang)器(qi)那(na)樣(yang)裂解得(de)比(bi)較(jiao)充(chong)分(fen)。

5.溶(rong)解NobleRyder RIPA Lysis Buffer時，應(ying)盡量縮短溶(rong)解時(shi)間(jian)，避免有效(xiao)成(cheng)分(fen)失(shi)效(xiao)。

6.裂解產(chan)物中(zhong)經常會出現(xian)壹小(xiao)團透(tou)明膠(jiao)狀(zhuang)物(wu)，屬正常現(xian)象(xiang)。該(gai)透(tou)明膠(jiao)狀(zhuang)物(wu)為(wei)含有基(ji)因(yin)組(zu)DNA等(deng)的(de)復(fu)合物(wu)。在不(bu)檢(jian)測和(he)基因(yin)組(zu)DNA結合(he)特別(bie)緊密(mi)的蛋(dan)白的(de)情況(kuang)下，可以直接離心(xin)取(qu)上(shang)清用於後續實驗；如果(guo)需要檢(jian)測和(he)基因(yin)組(zu)結合(he)特別(bie)緊密(mi)的蛋(dan)白，則(ze)可(ke)以通(tong)過超聲(sheng)處理打碎打(da)散(san)該(gai)透(tou)明膠(jiao)狀(zhuang)物(wu)，隨(sui)後(hou)離(li)心(xin)取(qu)上(shang)清用於後續實驗。如果(guo)檢(jian)測壹(yi)些常見的(de)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)，例(li)如NF-KB、p53等(deng)時(shi)，通(tong)常不(bu)必進行(xing)超(chao)聲處(chu)理，就(jiu)可以檢(jian)測到這(zhe)些轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)。

7.細胞(bao)裂解的(de)操作步(bu)驟，應置(zhi)於冰上或(huo)4℃進行(xing)。

有效(xiao)期： 12個月(yue)有效(xiao)。