多(duo)種(zhong)成分(fen)均可(ke)以從(cong)細(xi)胞中(zhong)提取(qu)總蛋(dan)白，例(li)如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(強)(Enhanced RIPA lysis buffer ,without inhibitors)是采(cai)用(yong)壹種(zhong)經典的細(xi)胞組(zu)織(zhi)快(kuai)速裂(lie)解(jie)，並獲(huo)得(de)總(zong)蛋(dan)白的裂(lie)解(jie)液(ye)，其裂解(jie)強(qiang)度大(da)於NP-40裂解(jie)液(ye)、RIPA裂解(jie)液(ye)(中(zhong))。所(suo)獲(huo)得(de)的蛋(dan)白質(zhi)可以(yi)用(yong)於Western，免(mian)疫沈澱
諾(nuo)博(bo)萊德(de) RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(強,無抑制劑(ji))樣(yang)本裂解(jie)

諾(nuo)博(bo)萊德(de) RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(強,無抑制劑(ji))樣(yang)本裂解(jie)

產品簡(jian)介：

   多(duo)種(zhong)成分(fen)均可(ke)以從(cong)細(xi)胞中(zhong)提取(qu)總蛋(dan)白，例(li)如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(強)(Enhanced RIPA lysis buffer ,without inhibitors)是采(cai)用(yong)壹種(zhong)經典的細(xi)胞組(zu)織(zhi)快(kuai)速裂(lie)解(jie)，並獲(huo)得(de)總(zong)蛋(dan)白的裂(lie)解(jie)液(ye)，其裂解(jie)強(qiang)度大(da)於NP-40裂解(jie)液(ye)、RIPA裂解(jie)液(ye)(中(zhong))。所(suo)獲(huo)得(de)的蛋(dan)白質(zhi)可以(yi)用(yong)於Western，免(mian)疫沈澱(Immunol Precipitation，IP)等(deng)。

    Enhanced RIPA lysis buffer without inhibitors 主(zhu)要(yao)由Tris、NP-40、sodium deoxycholate等組(zu)成，不(bu)含(han)蛋(dan)白酶和磷(lin)酸(suan)酶抑制劑(ji)，並維(wei)持原(yuan)有的蛋(dan)白間(jian)相互(hu)作用(yong)。

產品組(zu)成： 

諾(nuo)博(bo)萊德(de) RIPA裂(lie)解(jie)液(ye)(強,無抑制劑(ji))樣(yang)本裂解(jie)

操作步(bu)驟(zhou)(僅(jin)供參(can)考(kao))： 

(壹)貼(tie)壁培(pei)養細胞

1、取Enhanced RIPA lysis buffer室(shi)溫溶(rong)解(jie)混(hun)勻(yun)，根(gen)據需要(yao)選擇(ze)添加(jia)或不添(tian)加(jia)抑制(zhi)劑(ji)。

2、去除貼壁(bi)細(xi)胞的培(pei)養液(ye)，用PBS、NS或無血清培(pei)養液(ye)清洗(xi)1次，低(di)速(su)離(li)心(xin)，棄上(shang)清，留(liu)取沈(chen)澱。

3、按照 6 孔(kong)板每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)150～250μl含(han)有PMSF的裂(lie)解(jie)液(ye)的比(bi)例(li)， 加(jia)入(ru) RIPA Lysis Buffer  。移(yi)液(ye)器輕輕吹(chui)打，使(shi)裂解(jie)液(ye)和細(xi)胞充分(fen)接(jie)觸(chu)。置(zhi)於冰上或4℃裂解(jie)15～30min，通(tong)常裂(lie)解(jie)液(ye)作用(yong)於(yu)細胞 1～3 秒內，細(xi)胞(bao)就會被(bei)裂(lie)解(jie)。通(tong)常 6 孔(kong)板每(mei)孔(kong)細胞(bao)加(jia)入(ru) 150μl裂解(jie)液(ye)已經足夠(gou)，但如果(guo)細(xi)胞密度非常高可以(yi)適當加(jia)大(da)裂解(jie)液(ye)的用(yong)量到(dao)200～250μl。

4、10000～12000g，4℃離心(xin)5～10min(如無低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機，室(shi)溫下離心(xin)亦可(ke))，取上清。

5、進行後續的SDS-PAGE、Western、免(mian)疫沈澱和(he)免(mian)疫共(gong)沈(chen)澱等(deng)操作。

(二)懸(xuan)浮培(pei)養細胞

1、取 Enhanced RIPA Lysis Buffer室(shi)溫溶(rong)解(jie)混(hun)勻(yun)，根(gen)據需要(yao)選擇(ze)添加(jia)或不添(tian)加(jia)抑制(zhi)劑(ji)。

2、低(di)速(su)離(li)心(xin)懸浮細(xi)胞，棄上(shang)清，收(shou)集沈(chen)澱。

3、用手(shou)指(zhi)輕彈(dan)細(xi)胞，使其松散。按照 6 孔(kong)板每(mei)孔(kong)細胞(bao)加(jia)入(ru) 150～250μl裂解(jie)液(ye)的比(bi)例(li)，加(jia)入(ru) Enhanced  RIPA Lysis Buffer。通常(chang) 6 孔(kong)板每(mei)孔(kong)細胞(bao)加(jia)入(ru) 150μl裂解(jie)液(ye)已經足夠(gou)，但如果(guo)細(xi)胞密度非常高可以(yi)適當加(jia)大(da)裂解(jie)液(ye)的用(yong)量到(dao) 200～250μl。再用(yong)手(shou)指(zhi)輕彈(dan)以(yi)充分(fen)裂解(jie)細(xi)胞，充分(fen)裂解(jie)後應沒有明(ming)顯(xian)的細(xi)胞沈(chen)澱。

4、 10000～12000g，4℃離心(xin) 5～10min(如無低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機，室(shi)溫下離心(xin)亦可(ke))，取上清。

5、  進行後續的 SDS-PAGE、Western、免(mian)疫沈澱和(he)免(mian)疫共(gong)沈(chen)澱等(deng)操作。

(三)組(zu)織(zhi)樣(yang)本

1、取 Enhanced Lysis Buffer  置(zhi)於室(shi)溫溶(rong)解(jie)混(hun)勻(yun)，根(gen)據需要(yao)選擇(ze)添加(jia)或不添(tian)加(jia)抑制(zhi)劑(ji)。

2、把組(zu)zhi剪切(qie)成細(xi)小的碎(sui)片(pian)，越(yue)小越(yue)好。取(qu)在(zai)液(ye)氮或超低(di)溫(wen)冰(bing)箱(xiang)中(zhong)冷凍(dong) 30min 以上(shang)的組(zu)織(zhi)，迅(xun)速(su)用(yong)液(ye)氮研磨，研磨過(guo)程(cheng)盡量(liang)控制在1～2min 之內(nei)，以(yi)減(jian)少蛋(dan)白的降(jiang)解(jie)。

3、按照每20mg組(zu)織(zhi)加(jia)入(ru) 150～250μl 裂解(jie)液(ye)的比(bi)例(li)加(jia)入(ru)含(han)有 PMSF 的裂(lie)解(jie)液(ye)。冰上(shang)或 4℃裂解(jie) 15-30min。

4、步(bu)驟(zhou) 3、4 亦可以(yi)采用(yong)如下過程(cheng)：按照每 20mg 組(zu)織(zhi)加(jia)入(ru) 150～250μl 裂解(jie)液(ye)的比(bi)例(li)加(jia)入(ru)含(han)有 PMSF 的 Enhanced  RIPA Lysis Buffer。用(yong)玻璃(li)勻(yun)漿器或組(zu)織(zhi)研磨器勻(yun)漿，直至充分(fen)裂解(jie)，該(gai)過程(cheng)盡量(liang)控制在 1～2min 之內(nei)，以(yi)減(jian)少蛋(dan)白的降(jiang)解(jie)。

5、10000～12000g，4℃離心(xin) 5～10min(如無低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機，室(shi)溫下離心(xin)亦可(ke))，取上清。

6、進行後續的 PAGE、Western、免(mian)疫沈澱和(he)免(mian)疫共(gong)沈(chen)澱等(deng)操作。

註(zhu)意事項：

1、去除貼壁(bi)細(xi)胞的培(pei)養液(ye)後，如果(guo)血清中(zhong)的蛋(dan)白沒(mei)有幹(gan)擾(rao)，可以不(bu)用(yong)清洗(xi)。

2、如果(guo)裂(lie)解(jie)不(bu)充分(fen)可以(yi)適當增加(jia)裂解(jie)液(ye)的用(yong)量，如果(guo)需(xu)要高濃度(du)的蛋(dan)白樣(yang)品，可(ke)以適(shi)當減(jian)少裂解(jie)液(ye)的用(yong)量。

3、如果(guo)細(xi)胞量較多(duo)，必(bi)需(xu)分(fen)裝成 50～100 萬(wan)細胞/離(li)心(xin)管，然後再裂(lie)解(jie)。大(da)團(tuan)的細(xi)胞較(jiao)難(nan)裂解(jie)充分(fen)，而少量的細(xi)胞由(you)於(yu)裂(lie)解(jie)液(ye)容易(yi)和細(xi)胞充分(fen)接(jie)觸(chu)，相對(dui)比(bi)較容(rong)易裂(lie)解(jie)充分(fen)。

4、如果(guo)組(zu)織(zhi)樣(yang)品本身非常細小，可(ke)以適(shi)當剪切(qie)後直接(jie)加(jia)入(ru)裂解(jie)液(ye)裂解(jie)，通(tong)過強(qiang)烈 Vortex使樣(yang)品裂(lie)解(jie)充分(fen)。然後同樣離心(xin)取上(shang)清，用(yong)於(yu)後續實驗。

5、溶(rong)解(jie)RIPA Lysis Buffer 時(shi)，應盡量縮(suo)短(duan)溶(rong)解(jie)時(shi)間，避免(mian)有效(xiao)成分(fen)失效(xiao)。

6、裂解(jie)產物(wu)中(zhong)經常會(hui)出現壹(yi)小(xiao)團(tuan)透(tou)明(ming)膠狀(zhuang)物(wu)，屬正常(chang)現(xian)象(xiang)。該(gai)透(tou)明(ming)膠狀(zhuang)物(wu)為含(han)有基(ji)因組(zu)DNA 等(deng)的復(fu)合物(wu)。在不(bu)檢(jian)測(ce)和(he)基(ji)因組(zu) DNA 結(jie)合(he)特別緊(jin)密的蛋(dan)白的情(qing)況(kuang)下，可以(yi)直接(jie)離心(xin)取上(shang)清用(yong)於(yu)後續實驗；如果(guo)需(xu)要檢(jian)測(ce)和(he)基(ji)因組(zu)結(jie)合(he)特別緊(jin)密的蛋(dan)白，則(ze)可以通過超聲處理打(da)碎(sui)打(da)散該透明(ming)膠狀(zhuang)物(wu)，隨(sui)後離心(xin)取上(shang)清用(yong)於(yu)後續實驗。如果(guo)檢(jian)測(ce)壹(yi)些(xie)常見的轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)，例(li)如 NF-KB、p53 等時(shi)，通常(chang)不必(bi)進行超聲處理，就可以(yi)檢(jian)測(ce)到(dao)這(zhe)些(xie)轉(zhuan)錄(lu)因子。

7、  細胞(bao)裂解(jie)的操作步(bu)驟(zhou)，應置於冰(bing)上或 4℃進行。 

有效(xiao)期(qi)：12個月(yue)有效(xiao)。