多(duo)種(zhong)成(cheng)分(fen)均可以(yi)從(cong)細胞中(zhong)提(ti)取總蛋(dan)白(bai)。Western及(ji)IP細胞裂(lie)解(jie)液是(shi)采(cai)用壹(yi)種(zhong)非變性裂(lie)解(jie)方法來(lai)裂(lie)解(jie)細胞，並獲(huo)得(de)總蛋(dan)白(bai)的裂(lie)解(jie)液。所(suo)獲(huo)得(de)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)可以(yi)用於PAGE電(dian)泳，Western，免(mian)疫沈(chen)澱(dian)和免(mian)疫共(gong)沈(chen)澱(dian)(co-IP)等，含有(you)多(duo)種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑成(cheng)分(fen)，可以(yi)有(you)效(xiao)抑(yi)制蛋(dan)白(bai)的降解(jie)，並維持原(yuan)有(you)的蛋(dan)白(bai)間相(xiang)互(hu)作(zuo)用。
諾博萊(lai)德(de) Western及(ji)IP細胞裂(lie)解(jie)液 樣本(ben)裂(lie)解(jie)

諾博萊(lai)德(de) Western及(ji)IP細胞裂(lie)解(jie)液 樣本(ben)裂(lie)解(jie)

產品簡介(jie)：

多(duo)種(zhong)成(cheng)分(fen)均可以(yi)從(cong)細胞中(zhong)提(ti)取總蛋(dan)白(bai)，如(ru)Triton、SDS、NP-40等。Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液是(shi)采(cai)用壹(yi)種(zhong)非變性裂(lie)解(jie)方法來(lai)裂(lie)解(jie)細胞，並獲(huo)得(de)總蛋(dan)白(bai)的裂(lie)解(jie)液。所(suo)獲(huo)得(de)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)可以(yi)用於PAGE電(dian)泳，Western，免(mian)疫沈(chen)澱(dian)(Immunol Precipitation,IP)和免(mian)疫共(gong)沈(chen)澱(dian)(co-IP)等，主要由(you)Tris-HCl、NaCl、低(di)濃(nong)度Triton X-100， 低(di)濃(nong)度sodium pyrophosphate等組(zu)成(cheng)，並含有(you)多(duo)種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑成(cheng)分(fen)，可以(yi)有(you)效(xiao)抑(yi)制蛋(dan)白(bai)的降解(jie)，並維持原(yuan)有(you)的蛋(dan)白(bai)間相(xiang)互(hu)作(zuo)用。

用NobleRyder Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液得(de)到的蛋(dan)白(bai)，可(ke)以(yi)用BCA蛋(dan)白(bai)定量(liang)試(shi)劑盒(he)測定蛋(dan)白(bai)濃(nong)度。由(you)於含有(you)較高(gao)濃(nong)度的Triton X-100等幹擾(rao)物(wu)質(zhi)，不宜(yi)用Bradford法(fa)測定由(you)Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液獲(huo)得(de)樣本(ben)的蛋(dan)白(bai)濃(nong)度。

產品組(zu)成(cheng)：

諾博萊(lai)德(de) Western及(ji)IP細胞裂(lie)解(jie)液 樣本(ben)裂(lie)解(jie)

操(cao)作步驟(僅供(gong)參考)：

(壹)貼(tie)壁(bi)培(pei)養細胞

取Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液置於室(shi)溫溶解(jie)混勻，加入PMSF，使(shi)PMSF終濃(nong)度為(wei)1mM。

去除(chu)貼(tie)壁(bi)細胞的培(pei)養液(ye)，用PBS、NS或(huo)無(wu)血(xue)清(qing)培(pei)養液(ye)清(qing)洗(xi)1次(ci)，低(di)速(su)離心，棄(qi)上(shang)清(qing)，留取沈(chen)澱(dian)。

按照6孔(kong)板每(mei)孔(kong)加入100～200μl含有(you)PMSF的裂(lie)解(jie)液的比例，加入Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液。移(yi)液器(qi)輕(qing)輕吹(chui)打，使(shi)裂(lie)解(jie)液和細胞充(chong)分(fen)接觸。通(tong)常裂(lie)解(jie)液作(zuo)用於細胞1～5s內(nei)，細胞就會(hui)被裂(lie)解(jie)。

10000～12000g，離心(xin)3～5min(如(ru)果用冷凍(dong)離(li)心機4℃離心效(xiao)果更(geng)佳)，取上(shang)清(qing)。

進行(xing)後(hou)續(xu)的SDS-PAGE、Western、免(mian)疫沈(chen)澱(dian)和免(mian)疫共(gong)沈(chen)澱(dian)等操(cao)作。

(二)懸(xuan)浮培(pei)養細胞

取Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液置於室(shi)溫溶解(jie)混勻，加入PMSF，使(shi)PMSF終濃(nong)度為(wei)1mM。

低(di)速(su)離心懸(xuan)浮細胞，棄(qi)上(shang)清(qing)，收集(ji)沈(chen)澱(dian)。

用手指(zhi)輕(qing)彈細胞，使(shi)其(qi)松(song)散(san)。按照6孔(kong)板每(mei)孔(kong)細胞加(jia)入100～200μl含有(you)PMSF的裂(lie)解(jie)液的比例，加入Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液。通(tong)常6孔(kong)板每(mei)孔(kong)細胞加(jia)入100μl裂(lie)解(jie)液已(yi)經足夠，但(dan)如(ru)果細胞密(mi)度非常高(gao)可以(yi)適(shi)當(dang)加大裂(lie)解(jie)液的用量(liang)到150～200μl，再用手指(zhi)輕(qing)彈以(yi)充(chong)分(fen)裂(lie)解(jie)細胞。充(chong)分(fen)裂(lie)解(jie)後(hou)應(ying)沒(mei)有(you)明顯(xian)的細胞沈(chen)澱(dian)。

10000～12000g，4℃離心(xin)3～5min(如(ru)無(wu)低(di)溫離心(xin)機，室溫下離(li)心亦(yi)可(ke))，取上(shang)清(qing)。

進行(xing)後(hou)續(xu)的PAGE、Western、免(mian)疫沈(chen)澱(dian)等操(cao)作。

(三)組(zu)織(zhi)樣本(ben)

取Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液置於室(shi)溫溶解(jie)混勻，加入PMSF，使(shi)PMSF終濃(nong)度為(wei)1mM。

把(ba)組(zu)zhi剪切(qie)成(cheng)細小(xiao)的碎片，越小(xiao)越好(hao)。

取在液氮或超(chao)低(di)溫冰箱(xiang)中(zhong)冷凍(dong)30min以(yi)上(shang)的組(zu)織(zhi)，迅(xun)速(su)用液(ye)氮(dan)研(yan)磨，研(yan)磨過程盡(jin)量(liang)控制(zhi)在1～2min之內，以(yi)減(jian)少(shao)蛋(dan)白(bai)的降解(jie)。

按照每(mei)20mg組(zu)織(zhi)加入100～200μl裂(lie)解(jie)液的比例，加入含有(you)PMSF的裂(lie)解(jie)液。冰(bing)上(shang)或4℃裂(lie)解(jie)30～60min。

步驟3、4亦(yi)可以(yi)采(cai)用如(ru)下過程：按照每(mei)20mg組(zu)織(zhi)加入100～200μl裂(lie)解(jie)液的比例加入含有(you)PMSF的Western及IP細胞裂(lie)解(jie)液。用玻(bo)璃勻漿器(qi)或(huo)組(zu)織(zhi)研(yan)磨器(qi)勻漿，直(zhi)至(zhi)充(chong)分(fen)裂(lie)解(jie)，過程盡(jin)量(liang)控制(zhi)在1～2min之內，以(yi)減(jian)少(shao)蛋(dan)白(bai)的降解(jie)。

按照每(mei)20mg組(zu)織(zhi)加入100～200μl裂(lie)解(jie)液的比例，加入含有(you)PMSF的裂(lie)解(jie)液。

10000～12000g，4℃離心(xin)10～15min(如(ru)無(wu)低(di)溫離心(xin)機，室溫下離(li)心亦(yi)可(ke))，取上(shang)清(qing)。

進行(xing)後(hou)續(xu)的PAGE、Western、免(mian)疫沈(chen)澱(dian)和免(mian)疫共(gong)沈(chen)澱(dian)等操(cao)作。

註(zhu)意事(shi)項：

1.去除(chu)貼(tie)壁(bi)細胞的培(pei)養液(ye)時(shi)，如(ru)果血(xue)清(qing)中的蛋(dan)白(bai)沒(mei)有(you)幹擾(rao)，可(ke)以(yi)不用清(qing)洗(xi)。

2.如(ru)果裂(lie)解(jie)不充(chong)分(fen)可以(yi)適(shi)當(dang)增加裂(lie)解(jie)液的用量(liang)，如(ru)果需(xu)要高(gao)濃(nong)度的蛋(dan)白(bai)樣品，可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)減少裂(lie)解(jie)液的用量(liang)。

3.如(ru)果細胞量(liang)較多(duo)，必需(xu)分(fen)裝(zhuang)成(cheng)50～100萬(wan)細胞/離(li)心(xin)管(guan)，然(ran)後(hou)再裂(lie)解(jie)。大團(tuan)的細胞較(jiao)難(nan)裂(lie)解(jie)充(chong)分(fen)，而少量(liang)的細胞由(you)於裂(lie)解(jie)液容易(yi)和細胞充(chong)分(fen)接觸，相(xiang)對(dui)比(bi)較容易(yi)裂(lie)解(jie)充(chong)分(fen)。

4.如(ru)果組(zu)織(zhi)樣品本(ben)身非常細小(xiao)，可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)剪切(qie)後(hou)直(zhi)接(jie)加入裂(lie)解(jie)液裂(lie)解(jie)，通(tong)過強烈Vortex使(shi)樣品裂(lie)解(jie)充(chong)分(fen)。然後(hou)同樣離心(xin)取上(shang)清(qing)，用於後(hou)續(xu)實(shi)驗(yan)。直(zhi)接(jie)裂(lie)解(jie)的優(you)點(dian)是(shi)比(bi)較(jiao)方便，不必(bi)使(shi)用勻漿器(qi)，缺(que)點(dian)是(shi)不如(ru)使(shi)用勻漿器(qi)那(na)樣裂(lie)解(jie)得(de)比較(jiao)充(chong)分(fen)。

5.溶解(jie)NobleRyder Cell lysis buffer for Western and IP時(shi)，應(ying)盡(jin)量(liang)縮短(duan)溶(rong)解(jie)時(shi)間，避免(mian)裂(lie)解(jie)液中(zhong)的有效成(cheng)分(fen)失效。

6.細胞裂(lie)解(jie)的操(cao)作步驟，應(ying)置於冰(bing)上(shang)或4℃進行(xing)。

有效(xiao)期： 12個(ge)月(yue)有效(xiao)。