多(duo)種成分(fen)均(jun)可以(yi)從(cong)細胞(bao)中提取總(zong)蛋白(bai)，Western及(ji)IP細(xi)胞(bao)裂解液(ye)是(shi)采用壹種非變(bian)性裂解方(fang)法來(lai)裂(lie)解細胞(bao)，並(bing)獲(huo)得總蛋白(bai)的(de)裂解液(ye)。所(suo)獲(huo)得(de)的(de)蛋白(bai)質可以(yi)用於PAGE電泳，Western，免疫(yi)沈(chen)澱(Immunol Precipitation,IP)和(he)免(mian)疫(yi)共沈(chen)澱(co-IP)等(deng)，不含蛋白(bai)酶、磷酸(suan)酶抑制(zhi)劑，並(bing)維(wei)持原有(you)的(de)蛋白(bai)間(jian)相(xiang)互作用。
諾(nuo)博(bo)萊德 Western及(ji)IP細胞(bao)裂解液(ye)無(wu)抑(yi)制(zhi)劑

諾(nuo)博(bo)萊德 Western及(ji)IP細胞(bao)裂解液(ye)無(wu)抑(yi)制(zhi)劑

產(chan)品簡(jian)介(jie)：

多(duo)種成分(fen)均(jun)可以(yi)從(cong)細胞(bao)中提取總(zong)蛋白(bai)，如Triton、SDS、NP-40等(deng)，Western及IP細(xi)胞(bao)裂解液(ye)是(shi)采用壹種非變(bian)性裂解方(fang)法來(lai)裂(lie)解細胞(bao)，並(bing)獲(huo)得總蛋白(bai)的(de)裂解液(ye)。所(suo)獲(huo)得(de)的(de)蛋白(bai)質可以(yi)用於PAGE電泳，Western，免疫(yi)沈(chen)澱(Immunol Precipitation,IP)和(he)免(mian)疫(yi)共沈(chen)澱(co-IP)等(deng)，主要由Tris-HCl、NaCl、低濃度Triton X-100， 低濃度sodium pyrophosphate等(deng)組(zu)成，不含蛋白(bai)酶、磷酸(suan)酶抑制(zhi)劑，並(bing)維(wei)持原有(you)的(de)蛋白(bai)間(jian)相(xiang)互作用。

用Western及IP細(xi)胞(bao)裂解液(ye)(無(wu)抑(yi)制(zhi)劑)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)得(de)到的(de)蛋白(bai)，可以(yi)用BCA蛋白(bai)定(ding)量(liang)試(shi)劑盒(he)測(ce)定(ding)蛋白(bai)濃度。由於含有(you)較(jiao)高(gao)濃度的(de)Triton X-100等(deng)幹(gan)擾(rao)物(wu)質，不宜用Bradford法測(ce)定(ding)由Western及(ji)IP細胞(bao)裂解液(ye)獲(huo)得(de)樣(yang)本的(de)蛋白(bai)濃度。

產(chan)品組(zu)成：

諾(nuo)博(bo)萊德 Western及(ji)IP細胞(bao)裂解液(ye)無(wu)抑(yi)制(zhi)劑

操作步驟(僅(jin)供(gong)參考(kao))：

(壹(yi))貼(tie)壁培養細(xi)胞(bao)

取(qu)Western及(ji)IP細胞(bao)裂解液(ye)室溫溶(rong)解混勻，根(gen)據需要選(xuan)擇(ze)添加(jia)或(huo)不添加(jia)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑。

去(qu)除(chu)貼壁細胞(bao)的(de)培養液(ye)，用PBS、NS或無(wu)血清培養液(ye)清洗1次(ci)，低速(su)離(li)心(xin)，棄上(shang)清，留取沈(chen)澱。

按照(zhao)6孔板每孔加(jia)入(ru)100～200μl裂解液(ye)的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入(ru)Western及IP細(xi)胞(bao)裂解液(ye)。移(yi)液(ye)器(qi)輕(qing)輕(qing)吹打(da)，使裂解液(ye)和(he)細(xi)胞(bao)充分接觸(chu)。通常裂解液(ye)作用於細胞(bao)1～5s內，細胞(bao)就會被(bei)裂(lie)解。

10000～12000g，離(li)心(xin)3～5min(如果(guo)用冷(leng)凍離心(xin)機4℃離(li)心(xin)效果(guo)更(geng)佳(jia))，取上(shang)清。

進行後續(xu)的(de)SDS-PAGE、Western、免疫(yi)沈(chen)澱和(he)免(mian)疫(yi)共沈(chen)澱等(deng)操作。

(二(er))懸(xuan)浮(fu)培養細(xi)胞(bao)

1、 取(qu)Western及(ji)IP細胞(bao)裂解液(ye)室溫溶(rong)解混勻，根(gen)據需要選(xuan)擇(ze)添加(jia)或(huo)不添加(jia)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑。

2、 低速(su)離(li)心(xin)懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)，棄上清，收集(ji)沈(chen)澱。

3、 用手指輕(qing)彈細(xi)胞(bao)，使其松散。按照(zhao)6孔板每孔細胞(bao)加(jia)入(ru)100～200μl裂解液(ye)的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入(ru)Western及IP細(xi)胞(bao)裂解液(ye)。通常6孔板每孔細胞(bao)加(jia)入(ru)100μl裂解液(ye)已(yi)經(jing)足(zu)夠(gou)，但(dan)如果(guo)細(xi)胞(bao)密度非(fei)常高(gao)可以(yi)適(shi)當加(jia)大(da)裂(lie)解液(ye)的(de)用量到150～200μl，再(zai)用手指輕(qing)彈以(yi)充分裂解細胞(bao)。充分裂解後應沒(mei)有(you)明顯(xian)的(de)細胞(bao)沈(chen)澱。

4、 10000～12000g，4℃離(li)心(xin)3～5min(如無低溫(wen)離(li)心(xin)機，室溫下(xia)離(li)心(xin)亦(yi)可)，取(qu)上(shang)清。

5、 進行後續(xu)的(de)PAGE、Western、免疫(yi)沈(chen)澱等(deng)操作。

(三(san))組(zu)織(zhi)樣本

1、 取(qu)Western及(ji)IP細胞(bao)裂解液(ye)置(zhi)於室溫溶(rong)解混勻，根(gen)據實(shi)驗(yan)需要選(xuan)擇(ze)添加(jia)或(huo)不添加(jia)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑。

2、 把(ba)組(zu)zhi剪切(qie)成細(xi)小的(de)碎片(pian)，越(yue)小(xiao)越(yue)好。

3、 取(qu)在(zai)液(ye)氮(dan)或(huo)超(chao)低溫(wen)冰(bing)箱中(zhong)冷(leng)凍30min以上的(de)組(zu)織(zhi)，迅速(su)用液(ye)氮(dan)研磨(mo)，研磨(mo)過程盡(jin)量(liang)控制在1～2min之(zhi)內(nei)，以減(jian)少(shao)蛋白(bai)的(de)降解。

4、 按照(zhao)每20mg組(zu)織(zhi)加(jia)入(ru)100～200μl裂解液(ye)的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入(ru)含有(you)PMSF的(de)裂解液(ye)。冰(bing)上或(huo)4℃裂(lie)解30～60min。

5、 步驟3、4亦(yi)可以(yi)采用如下(xia)過程：按照(zhao)每20mg組(zu)織(zhi)加(jia)入(ru)100～200μl裂解液(ye)的(de)比(bi)例(li)加(jia)入(ru)Western及IP細(xi)胞(bao)裂解液(ye)。用玻璃(li)勻漿(jiang)器(qi)或組(zu)織(zhi)研磨(mo)器(qi)勻漿(jiang)，直至(zhi)充分裂解，過程盡(jin)量(liang)控制在1～2min之(zhi)內(nei)，以減(jian)少(shao)蛋白(bai)的(de)降解。

6、 按照(zhao)每20mg組(zu)織(zhi)加(jia)入(ru)100～200μl裂解液(ye)的(de)比(bi)例(li)，加(jia)入(ru)Western及IP細(xi)胞(bao)裂解液(ye)。

7、 10000～12000g，4℃離(li)心(xin)10～15min(如無低溫(wen)離(li)心(xin)機，室溫下(xia)離(li)心(xin)亦(yi)可)，取(qu)上(shang)清。

8、 進行後續(xu)的(de)PAGE、Western、免疫(yi)沈(chen)澱和(he)免(mian)疫(yi)共沈(chen)澱等(deng)操作。

註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)：

1.去(qu)除(chu)貼壁細胞(bao)的(de)培養液(ye)時(shi)，如果(guo)血(xue)清中的(de)蛋白(bai)沒(mei)有(you)幹(gan)擾(rao)，可以(yi)不用清洗。

2.如果(guo)裂(lie)解不充分可以(yi)適(shi)當增加(jia)裂(lie)解液(ye)的(de)用量，如果(guo)需要高(gao)濃度的(de)蛋白(bai)樣(yang)品(pin)，可以(yi)適(shi)當減(jian)少(shao)裂(lie)解液(ye)的(de)用量。

3.如果(guo)細(xi)胞(bao)量較(jiao)多(duo)，必需分(fen)裝成50～100萬(wan)細胞(bao)/離心(xin)管，然(ran)後再(zai)裂(lie)解。大(da)團(tuan)的(de)細胞(bao)較(jiao)難(nan)裂解充分，而少(shao)量(liang)的(de)細胞(bao)由於裂解液(ye)容(rong)易(yi)和(he)細(xi)胞(bao)充分接觸(chu)，相(xiang)對比(bi)較(jiao)容(rong)易(yi)裂解充分。

4.如果(guo)組(zu)織(zhi)樣品本身非(fei)常(chang)細(xi)小(xiao)，可以(yi)適(shi)當剪切(qie)後(hou)直接(jie)加(jia)入(ru)裂解液(ye)裂(lie)解，通過強烈Vortex使樣品(pin)裂(lie)解充分。然後同樣離(li)心(xin)取上(shang)清，用於後續實驗(yan)。直接(jie)裂解的(de)優點是(shi)比(bi)較(jiao)方(fang)便(bian)，不必使用勻漿(jiang)器(qi)，缺(que)點是(shi)不如使用勻漿(jiang)5.器(qi)那樣(yang)裂(lie)解得比(bi)較(jiao)充分。

6.溶(rong)解NobleRyder Cell lysis buffer for Western and IP時(shi)，應(ying)盡量縮(suo)短(duan)溶(rong)解時間，避(bi)免裂解液(ye)中(zhong)的(de)有(you)效成分(fen)失效。

7.細(xi)胞(bao)裂解的(de)操作步驟，應置於冰(bing)上或(huo)4℃進行。

有(you)效期(qi)： 12個(ge)月(yue)有(you)效。