本試(shi)劑(ji)盒(he)適(shi)用於各種(zhong) RNA制品(pin)的反轉(zhuan)錄反應(ying)以(yi)及隨(sui)後的(de)PCR擴增(zeng)。
通用(yong)RT-PCR試劑(ji)盒(M-MLV) 核酸(suan)電(dian)泳

NobleRyder RP9988 通(tong)用RT-PCR試(shi)劑(ji)盒(he)(M-MLV) Universal RT-PCR Kit(M-MLV)

產(chan)品(pin)貨號(hao)：RP9988

產品(pin)名(ming)稱(cheng)：通(tong)用(yong)RT-PCR試(shi)劑盒(M-MLV) Universal RT-PCR Kit(M-MLV)

英(ying)文名(ming)稱(cheng)：Universal RT-PCR Kit(M-MLV)

產(chan)品(pin)別名(ming)：通(tong)用(yong)RT-PCR試(shi)劑(ji)盒(M-MLV) 反轉(zhuan)錄試劑(ji)盒(he)

產(chan)品(pin)規格：25T/50T/100T

通(tong)用RT-PCR試(shi)劑盒(he)(M-MLV) 核酸(suan)電(dian)泳

產品(pin)簡介(jie)：

儲(chu)存條(tiao)件：Store at -20℃，1 year.

具(ju)體產(chan)品(pin)的參數以(yi)收到產(chan)品(pin)說(shuo)明書(shu)的參(can)數為(wei)準(zhun)

NobleRyder RP9988 通用(yong)RT-PCR試劑(ji)盒(M-MLV) 本試劑(ji)盒(he)適(shi)用於各種(zhong) RNA制品(pin)的反轉(zhuan)錄反應(ying)以(yi)及隨(sui)後的(de)PCR擴增(zeng)。它采用(yong)M-MLV進(jin)行(xing)反轉(zhuan)錄反應(ying)，能夠獲(huo)得(de)較(jiao)長(chang)的(de)反轉(zhuan)錄產物(wu)。同(tong)時，在(zai)20ul反轉(zhuan)錄體系(xi)和50ul PCR反應(ying)體系(xi)中，還可(ke)以(yi)壹次(ci)性得(de)到足(zu)夠量的(de)PCR產物(wu)用(yong)於後續(xu)的克(ke)隆實(shi)驗。本(ben)試(shi)劑盒中配(pei)制的酶均(jun)為(wei)進(jin)口(kou)的(de)酶。RT酶采用(yong)進(jin)口(kou)的(de)M-MLV，所(suo)以(yi)cDNA更長(chang)，基(ji)因的信(xin)息保(bao)留(liu)得(de)更(geng)完(wan)整(zheng)！反轉(zhuan)錄過(guo)程(cheng)中(zhong)特(te)異(yi)的RNase抑(yi)制劑可(ke)有(you)效(xiao)降低由(you)於外源(yuan)RNase汙(wu)染而(er)導(dao)致實(shi)驗失(shi)敗(bai)的風險。本試劑盒(he)使用(yong)方(fang)便(bian)、快(kuai)捷，可(ke)廣泛(fan)用(yong)於cDNA克(ke)隆及(ji)目的基因檢測等(deng)分(fen)子生物(wu)學實(shi)驗。

通(tong)用(yong)RT-PCR試劑盒(M-MLV)產品(pin)簡介(jie)

莫(mo)洛尼(ni)鼠(shu)白血病(bing)病(bing)毒反轉(zhuan)錄酶（M-MLV RT）是(shi)壹(yi)種RNA依(yi)賴(lai)的(de)DNA聚合(he)酶，能使mRNA（>5kb）轉(zhuan)錄為cDNA。M-MLV RT的(de)RNase H活性(xing)相(xiang)對於禽成(cheng)髓細胞(bao)瘤(liu)病(bing)毒反轉(zhuan)錄酶較(jiao)弱(ruo)，更適(shi)合用(yong)來(lai)反轉(zhuan)錄較長(chang)的(de)mRNA。M-MLV RT應(ying)用於以(yi)RNA為模(mo)板(ban)合成(cheng)cDNA的(de)第(di)壹(yi)條鏈。

註(zhu)意(yi)：M-MLV RT的延伸性要低於AMV 反轉(zhuan)錄酶，因此(ci)要得(de)到和(he)用AMV 反轉(zhuan)錄酶壹(yi)樣(yang)產(chan)量的cDNA需加(jia)入更(geng)多單位的M-MLV反轉(zhuan)錄酶。

通(tong)用(yong)RT-PCR試劑(ji)盒(M-MLV)使用(yong)方(fang)法(fa)

1）使用(yong)方(fang)法(fa)簡介(jie)以(yi)用2mg總(zong)RNA為例(li)。在(zai)無RNase離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，加(jia)入0.5mg引(yin)物(wu)至含總RNA的(de)樣(yang)品(pin)中，總體積(ji)不大於15ml。70℃，5分(fen)鐘打(da)開(kai)模(mo)板(ban)鏈形成(cheng)的(de)二(er)級(ji)結構。立即(ji)放(fang)於冰上(shang)降溫(wen)防止(zhi)二級(ji)結構(gou)恢(hui)復(fu)，隨(sui)後短(duan)暫離心(xin)使液(ye)體集中在(zai)離心(xin)管(guan)底(di)。

2）加(jia)入以(yi)下(xia)成(cheng)分(fen)到已(yi)退火(huo)後的(de)引(yin)物(wu)-模(mo)板(ban)混合物(wu)中(zhong)。

註(zhu)意(yi)：不要改變(bian)引(yin)物(wu)的(de)加(jia)入比率。

M-MLV 5×Reaction Buffer：5ml

dATP，10mM：1.25ml

dCTP，10mM：1.25ml

dGTP，10mM：1.25ml

dTTP，10mM：1.25ml

Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor：25 units

M-MLV RT：200 units

無核酸(suan)水至最後體積(ji) 25ml

3）輕輕(qing)混勻(yun)離心(xin)管(guan)，如(ru)果(guo)使用(yong)隨機(ji)引(yin)物(wu)在(zai)37℃孵育(yu)60分(fen)鐘，其(qi)他引(yin)物(wu)則(ze)42℃孵(fu)育(yu)。延伸溫(wen)度在(zai)37～42℃之間優(you)良(liang)。

4）M-MLV RT 用於合成(cheng)cDNA的(de)第(di)壹(yi)鏈。往後的(de)合成(cheng)則(ze)需要根(gen)據(ju)需要自(zi)行(xing)設計(ji)引(yin)物(wu)再(zai)次(ci)合(he)成(cheng)。

通(tong)用(yong)RT-PCR試(shi)劑盒(M-MLV)Buffer組(zu)成(cheng)

M-MLV RT 5×Reaction Buffer

250mM Tris-HCl（PH 8.3 室(shi)溫(wen)下(xia)）

375mM KCl

15mM MgCl2

50mM DTT

通(tong)用RT-PCR試劑盒(he)(M-MLV)來(lai)源(yuan)

大腸桿菌表達(da)純(chun)化(hua)

通用(yong)RT-PCR試(shi)劑(ji)盒(M-MLV)保(bao)存(cun)條件

-20℃保(bao)存(cun)。避免經常(chang)凍(dong)融(rong)。

操(cao)作步(bu)驟(zhou)（僅供(gong)參考）：

壹、反轉(zhuan)錄反應(ying)

關(guan)於逆(ni)轉(zhuan)錄引(yin)物(wu)的(de)選(xuan)擇(ze)：

（1）如(ru)果(guo)模(mo)板(ban)為真(zhen)核生物(wu)來(lai)源(yuan)，建議(yi)用(yong)Oligo(dT)16 ，Oligo(dT)16可(ke)以(yi)與(yu)真(zhen)核生物(wu)mRNA 的(de)3’Poly A 尾配(pei)對，可獲(huo)得(de)高(gao)產(chan)量(liang)的(de)全(quan)長(chang)cDNA。

（2）模(mo)板(ban)為原(yuan)核生物(wu)RNA的(de)反轉(zhuan)錄請選(xuan)用Random引(yin)物(wu)或(huo)者(zhe)基因特(te)異(yi)性引(yin)物(wu)。

（3）Random引(yin)物(wu)適(shi)用於mRNA、tRNA 和rRNA 等(deng)所(suo)有(you)RNA的(de)反轉(zhuan)錄反應(ying)，對物(wu)種(zhong)沒(mei)有(you)限(xian)制，病毒、細菌、植(zhi)物(wu)、動(dong)物(wu)等(deng)都(dou)可使用(yong)。

1、在(zai)冰浴(yu)的(de)無(wu)RNase的(de)離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)加(jia)入如(ru)下(xia)反應(ying)成(cheng)分(fen)：

1-5μg 總 RNA或(huo)50-500ng mRNA

2μLOligo(dT)16或(huo) 2μLRandom 或(huo) 2pmole 基(ji)因特(te)異(yi)性引(yin)物(wu)

補(bu)RNase-free ddH2O 至 14.5μL

2、70℃保(bao)溫(wen)5min後迅(xun)速在(zai)冰上(shang)冷卻(que)2min，簡短(duan)離(li)心(xin)收(shou)集反應(ying)液後加(jia)入以(yi)下(xia)各(ge)組(zu)分(fen)：

4μL：5×M-MLVBuffer

1μL：dNTPs

0.5μL：RNasin

1μL：M-MLV

 3、42℃溫(wen)浴(yu)60min，如(ru)果(guo)是(shi)用(yong)Random引(yin)物(wu)，請先將離心(xin)管(guan)置25℃溫(wen)浴(yu)10min，再(zai)42℃溫(wen)浴(yu)60min。

4、95℃加(jia)熱5min終(zhong)止(zhi)反應(ying)，置冰上進(jin)行(xing)後續(xu)實(shi)驗或(huo)-20℃保(bao)存(cun)。

5、用RNase-free ddH2O 將反應(ying)體系(xi)稀釋到50μL，取2-5μL進(jin)行(xing)PCR反應(ying)。

二、PCR反應(ying)

2、混勻(yun)後短(duan)暫離心(xin)，PCR儀(yi)擴增(zeng)，瓊脂糖凝(ning)膠電(dian)泳觀(guan)察(cha)結果。

註意(yi)事(shi)項(xiang)：

1、用(yong)於cDNA合成(cheng)反應(ying)的相(xiang)關(guan)試(shi)劑(ji)和(he)耗(hao)材盡(jin)可(ke)能用DEPC進(jin)行(xing)處理(li)，並(bing)在(zai)高(gao)壓滅(mie)菌後使用(yong)。有(you)些(xie)試(shi)劑(ji)不能高(gao)壓滅(mie)菌時，首(shou)先用(yong)經過(guo)滅(mie)菌的(de)器具(ju)、水等(deng)配(pei)制溶液(ye)後，再(zai)將溶液進(jin)行(xing)過(guo)濾(lv)除(chu)菌處理(li)。

2、試劑(ji)盒的各組(zu)分(fen)應(ying)在(zai)-20℃保(bao)存(cun)，避免反復(fu)凍(dong)融(rong)，有(you)效(xiao)期(qi)12個月。

3、RNA樣(yang)品(pin)要避(bi)免反復(fu)多次凍(dong)融(rong)，應(ying)使RNA在(zai)冰浴(yu)中(zhong)處於融(rong)化(hua)狀態。

通(tong)用(yong)RT-PCR試(shi)劑盒(M-MLV) 核酸(suan)電(dian)泳

產(chan)品(pin)訂購(gou)信息(xi)：

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