2× miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix是(shi)使(shi)用SYBR Green I嵌合熒光法進(jin)行qPCR的2×試(shi)劑。主要成分包括(kuo)化學修飾的Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+、SYBR Green I和(he)針(zhen)對qPCR優(you)化的最(zui)適Buffer。
染料(liao)法qPCRMix 熒光定量

諾博(bo)萊德(de) 染料(liao)法qPCRMix

染料(liao)法qPCRMix   熒光定量

產品名稱：染料(liao)法qPCRMix
產品內容：

 產品簡介
2× miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix是(shi)使(shi)用SYBR Green I嵌合熒光法進(jin)行qPCR的2×試(shi)劑。主要成分包括(kuo)化學修飾的Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg²⁺、SYBR Green I和(he)針(zhen)對qPCR優(you)化的最(zui)適Buffer。本產品可在(zai)寬(kuan)廣(guang)的(de)定(ding)量區域(yu)內獲(huo)得(de)良(liang)好的標(biao)準(zhun)曲線，實(shi)驗結(jie)果(guo)重復性(xing)好(hao)、可信(xin)度高。另外，預混液(ye)體(ti)系中添加(jia)了特殊(shu)ROX Reference Dye，適用(yong)於不同qPCR 儀(yi)器(qi)，配置(zhi)反(fan)應(ying)體(ti)系時(shi)只需加(jia)入引(yin)物(wu)和(he)模(mo)板即可擴(kuo)增，適用(yong)於動物(wu)、植(zhi)物(wu)等miRNA的染料(liao)法熒光定量PCR。
註意(yi)事(shi)項(xiang)
1. 為了您(nin)的安(an)全和(he)健(jian)康，請(qing)穿(chuan)實(shi)驗服並戴壹(yi)次性(xing)手(shou)套操作。
2. 請(qing)於使用前確(que)保(bao)產品wan全解凍，che底(di)混勻後短暫離心(xin)，置(zhi)於冰(bing)上(shang)備(bei)用(yong)。
3. 反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)會影響產品性(xing)能(neng)。如(ru)每(mei)次(ci)用(yong)量較(jiao)少(shao)，推薦(jian)小(xiao)份(fen)分裝使(shi)用。
4. 本產品中含(han)熒光染料(liao)SYBR Green I，使用(yong)中應(ying)盡(jin)量避(bi)免(mian)強光照(zhao)射(she)。
實(shi)驗流程(cheng)
配制檢測(ce)試(shi)劑

1. 按(an)照(zhao)下表(biao)配置(zhi)PCR反(fan)應(ying)體(ti)系（註(zhu)：配置(zhi)多(duo)個反(fan)應(ying)孔時，請為各組分預留(liu)10%的余(yu)量，以(yi)免(mian)移液(ye)損(sun)失(shi)。）

*通(tong)常每條(tiao)引(yin)物(wu)終(zhong)濃度為0.2 μM，也(ye)可根(gen)據(ju)情(qing)況在0.1~0.4μM 間進(jin)行調整(zheng)。
*微量體積(ji)加(jia)樣時誤(wu)差(cha)大(da)，建(jian)議(yi)模(mo)板稀(xi)釋後再加(jia)入反(fan)應(ying)體(ti)系中，這(zhe)樣可以(yi)有效(xiao)提高(gao)實(shi)驗的重復性(xing)；如(ru)模(mo)板類(lei)型(xing)為未稀(xi)釋cDNA原液(ye)，使(shi)用體(ti)積(ji)不應超(chao)過qPCR反(fan)應(ying)總體積的 1/10。
 2. 反(fan)應(ying)體(ti)系配好後，蓋好反(fan)應(ying)蓋，充分渦(wo)旋(xuan)混(hun)勻，離心，避(bi)免(mian)產生(sheng)氣泡(pao)。
反(fan)應(ying)程(cheng)序設(she)置(zhi)

*延(yan)伸(shen)時間請(qing)根(gen)據(ju)您(nin)使用(yong)的Real Time qPCR儀(yi)數據(ju)采(cai)集(ji)最短時(shi)間限(xian)制(zhi)以(yi)及(ji)PCR產物(wu)長(chang)度自(zi)行(xing)調(tiao)整(zheng)。
結(jie)果(guo)分析(xi)
定(ding)量檢測(ce)至少需要三(san)個生物(wu)學重復，反(fan)應(ying)結(jie)束(shu)後(hou)需要確認(ren)擴(kuo)增曲線的(de)線形(xing)，熔(rong)解曲線的(de)峰(feng)形(xing)。
1. 擴(kuo)增曲線：標(biao)準(zhun)擴(kuo)增曲線為S型(xing)。
Ct值小於10，需要將模(mo)板稀(xi)釋後，重新進(jin)行實(shi)驗（每稀(xi)釋壹倍，Ct值(zhi)增大1）；
Ct值(zhi)30-35之間時(shi)，需要提高(gao)模(mo)板濃度，或(huo)者增大反(fan)應(ying)體(ti)系的(de)體積，以(yi)提(ti)高擴(kuo)增效率，保(bao)證(zheng)結(jie)果(guo)分析(xi)的(de)準(zhun)確性(xing)；
Ct值(zhi)大於35時，檢測(ce)結(jie)果(guo)不(bu)可信(xin)。
2. 熔(rong)解曲線：
熔(rong)解曲線單(dan)峰(feng)，表(biao)明反(fan)應(ying)特異(yi)性(xing)好(hao)可以(yi)進(jin)行定量結(jie)果(guo)分析(xi)；若(ruo)熔(rong)解曲線出(chu)現(xian)明顯雙(shuang)峰(feng)或(huo)者多(duo)峰(feng)，則(ze)不能(neng)進(jin)行定量分析(xi)，需要重新設(she)計引(yin)物(wu)。
常(chang)見(jian)問題與(yu)解決方(fang)案(an)
►擴(kuo)增曲線形(xing)狀異(yi)常
①擴(kuo)增曲線不(bu)光滑：確認(ren)所用ROX與(yu)機(ji)型(xing)是(shi)否(fou)匹配; 使用的八(ba)聯排(pai)管(guan)或(huo)PCR板(ban)可能(neng)與(yu)設(she)備(bei)不(bu)匹配。
②擴(kuo)增曲線突(tu)然(ran)驟(zhou)降(jiang)：反(fan)應(ying)管(guan)內(nei)留(liu)有氣泡(pao)。樣本離心(xin)後仔(zai)細檢查(zha)反(fan)應(ying)管(guan)內(nei)是(shi)否(fou)有氣泡(pao)殘留(liu)。
►反(fan)應(ying)結(jie)束(shu)無(wu)擴(kuo)增曲線出(chu)現(xian)
①循環(huan)數不夠(gou)：壹(yi)般(ban)設(she)置(zhi)為40個循環(huan)。
②確認(ren)程(cheng)序中是(shi)否(fou)設(she)置(zhi)了信號(hao)采(cai)集步驟(zhou)。
③確(que)認(ren)引(yin)物(wu)、模(mo)板是(shi)否(fou)降解。
④確認(ren)是(shi)否(fou)添加(jia)了ROX，嘗試(shi)將Passive Reference 設(she)置(zhi)為None，再重新分析(xi)數(shu)據(ju)。
►陰(yin)性(xing)對照(zhao)出(chu)現(xian)擴(kuo)增
①反(fan)應(ying)體(ti)系汙(wu)染：更換(huan)新的(de)Mix、水、引(yin)物(wu)重復實(shi)驗。在超(chao)凈工作臺(tai)進(jin)行反(fan)應(ying)體(ti)系配置(zhi)，減少氣溶(rong)膠汙染。
②產生(sheng)引(yin)物(wu)二聚體，配合溶解曲線進(jin)行分析(xi)。
③使(shi)用(yong)含(han)UDG/dUTP 防汙(wu)染體系的(de)擴(kuo)增試(shi)劑。
►實(shi)驗重復性(xing)差(cha)
①加(jia)樣體積(ji)失(shi)準(zhun)：建(jian)議(yi)使用大體積(ji)加(jia)樣以(yi)減少誤(wu)差(cha)。
②模(mo)板濃度太低(di)：模(mo)板濃度越(yue)低(di)，重復性(xing)越(yue)差(cha)，減少模(mo)板稀(xi)釋倍數(shu)或(huo)增加(jia)模(mo)板體(ti)積。
③反(fan)應(ying)體(ti)系未充(chong)分混勻(yun)：上(shang)機(ji)檢測(ce)前將(jiang)反(fan)應(ying)體(ti)系充(chong)分混勻(yun)後再離(li)心(xin)。

染料(liao)法qPCRMix   熒光定量