2× Universal SYBR qPCR Master Mix是(shi)使用SYBR Green I 嵌合(he)熒光(guang)法進(jin)行qPCR的(de)2×試(shi)劑。主要(yao)成(cheng)分(fen)包(bao)括化學修(xiu)飾(shi)的(de)Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+、SYBR Green I和(he)針對qPCR優化的(de)最適(shi)Buffer。
染料法(fa)qPCRMix 熒光(guang)定量

諾(nuo)博(bo)萊德 染料法(fa)qPCRMix

染料法(fa)qPCRMix 熒光(guang)定量

產品名(ming)稱(cheng)：染料法(fa)qPCRMix
產品內容：

 產品簡(jian)介(jie)：
2× Universal SYBR qPCR Master Mix是(shi)使用SYBR Green I 嵌合(he)熒光(guang)法進(jin)行qPCR的(de)2×試(shi)劑。主要(yao)成(cheng)分(fen)包(bao)括化學修(xiu)飾(shi)的(de)Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg²⁺、SYBR Green I和(he)針對qPCR優化的(de)最適(shi)Buffer。本(ben)產品可(ke)在(zai)寬廣(guang)的(de)定量區域(yu)內獲得(de)良(liang)好的(de)標(biao)準曲(qu)線(xian)，實驗(yan)結果(guo)重復性好、可(ke)信(xin)度(du)高(gao)。另(ling)外(wai)，預混液體系(xi)中添加了特(te)殊(shu)ROX Reference Dye，適(shi)用於不(bu)同qPCR 儀器，配置反(fan)應(ying)體系(xi)時只(zhi)需(xu)加入(ru)引物(wu)和(he)模板(ban)即(ji)可(ke)擴(kuo)增(zeng)。
 註(zhu)意(yi)事(shi)項：
1. 為了您的(de)安全和(he)健(jian)康，請穿(chuan)實驗(yan)服並戴(dai)壹次(ci)性手套(tao)操(cao)作(zuo)。
2. 請於使用前確(que)保產品wan全解(jie)凍(dong)，che底(di)混勻後短暫(zan)離(li)心(xin)，置於冰(bing)上備(bei)用。
3. 反(fan)復凍(dong)融會(hui)影(ying)響產品性能(neng)。如每次(ci)用量較少，推(tui)薦(jian)小(xiao)份分(fen)裝(zhuang)使用。
4. 本(ben)產品中(zhong)含熒(ying)光(guang)染料SYBR Green I，使用中應(ying)盡量避(bi)免(mian)強光(guang)照射。
實驗(yan)流程：
配制檢測試(shi)劑

1. 按照(zhao)下(xia)表配置PCR反(fan)應(ying)體系(xi)（註(zhu)：配(pei)置多個(ge)反(fan)應(ying)孔(kong)時，請為(wei)各組(zu)分(fen)預留(liu)10%的(de)余量，以(yi)免(mian)移液損(sun)失(shi)。）

*通(tong)常(chang)每條(tiao)引物(wu)終濃(nong)度為0.2 μM，也(ye)可(ke)根(gen)據(ju)情況(kuang)在(zai)0.1~0.4μM 間進(jin)行調整(zheng)。
*微量體積加樣(yang)時誤差(cha)大，建議模板(ban)稀(xi)釋後再加入反(fan)應(ying)體系(xi)中，這(zhe)樣可(ke)以(yi)有(you)效提高(gao)實驗(yan)的(de)重復性；如模板(ban)類(lei)型為未(wei)稀(xi)釋cDNA原液，使用體積不應(ying)超過qPCR反(fan)應(ying)總體積的(de) 1/10。
2. 反(fan)應(ying)體系(xi)配好(hao)後，蓋(gai)好反(fan)應(ying)蓋，充分(fen)渦(wo)旋(xuan)混勻，離(li)心(xin)，避(bi)免(mian)產生氣(qi)泡。
反(fan)應(ying)程序設置
標(biao)準程(cheng)序

 快速(su)程序

*延伸(shen)時間請(qing)根(gen)據(ju)您使用的(de)Real Time qPCR儀(yi)數據采集最短時間限(xian)制(zhi)以(yi)及PCR產物(wu)長(chang)度自(zi)行調整(zheng)。
*模板(ban)拷(kao)貝(bei)數較低時采用標(biao)準程(cheng)序可(ke)提(ti)高(gao)數據的(de)重現(xian)性。
結果(guo)分(fen)析(xi)：
定量檢測至(zhi)少需(xu)要三個(ge)生物(wu)學重復，反(fan)應(ying)結束後(hou)需(xu)要確(que)認擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)的(de)線(xian)形，熔解(jie)曲(qu)線(xian)的(de)峰(feng)形。
1. 擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)：標(biao)準擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)為S型。
Ct值(zhi)小(xiao)於10，需(xu)要將模板(ban)稀(xi)釋後，重新進(jin)行實驗(yan)（每稀(xi)釋壹倍(bei)，Ct值(zhi)增(zeng)大1）；
Ct值(zhi)30-35之(zhi)間(jian)時，需(xu)要提(ti)高(gao)模板(ban)濃(nong)度，或者(zhe)增(zeng)大反(fan)應(ying)體系(xi)的(de)體積，以(yi)提高(gao)擴(kuo)增(zeng)效率(lv)，保證(zheng)結(jie)果(guo)分(fen)析(xi)的(de)準(zhun)確性；
Ct值(zhi)大於35時，檢測結(jie)果不(bu)可(ke)信(xin)。
2. 熔(rong)解(jie)曲(qu)線(xian)：
熔解(jie)曲(qu)線(xian)單峰，表明反(fan)應(ying)特異(yi)性好可(ke)以(yi)進(jin)行定量結果(guo)分(fen)析(xi)；若熔(rong)解(jie)曲(qu)線(xian)出(chu)現(xian)明顯(xian)雙峰(feng)或者(zhe)多峰，則(ze)不(bu)能(neng)進(jin)行定量分(fen)析(xi)，需(xu)要重新設計引物(wu)。
常(chang)見問(wen)題(ti)與解(jie)決(jue)方案
►擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)形狀異(yi)常(chang)
①擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)不光(guang)滑：使用的(de)八(ba)聯排(pai)管(guan)或PCR板(ban)可(ke)能(neng)與設備(bei)不匹配，設備(bei)光(guang)源(yuan)可(ke)能(neng)松動。
②擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)突然(ran)驟(zhou)降(jiang)：反(fan)應(ying)管內留(liu)有(you)氣(qi)泡，樣本(ben)離(li)心(xin)後仔(zai)細(xi)檢查反(fan)應(ying)管內是(shi)否有(you)氣(qi)泡殘(can)留(liu)。
►反(fan)應(ying)結束無(wu)擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)出(chu)現(xian)
①循(xun)環數不夠(gou)：壹(yi)般設置為(wei)40個(ge)循(xun)環。
②確認程序中是(shi)否設置了信(xin)號(hao)采集步(bu)驟(zhou)。
③確(que)認引物(wu)、模板(ban)是(shi)否降(jiang)解(jie)。
►陰性對照(zhao)出(chu)現(xian)擴(kuo)增(zeng)
①反(fan)應(ying)體系(xi)汙染：更換(huan)新的(de)Mix、水、引物(wu)重復實驗(yan)。在(zai)超凈工作(zuo)臺進(jin)行反(fan)應(ying)體系(xi)配置，減(jian)少(shao)氣(qi)溶膠汙染。
②產生引物(wu)二(er)聚(ju)體，配合(he)溶解(jie)曲(qu)線(xian)進(jin)行分(fen)析(xi)。
③使用含UDG/dUTP 防(fang)汙染體系(xi)的(de)擴(kuo)增(zeng)試(shi)劑。
►實驗(yan)重復性差(cha)
①加(jia)樣體積失(shi)準：建議使用大體積加樣(yang)以(yi)減(jian)少(shao)誤差(cha)。
②模板(ban)濃(nong)度太低：模板(ban)濃(nong)度越(yue)低，重復性越(yue)差(cha)，減(jian)少(shao)模板(ban)稀(xi)釋倍(bei)數或增(zeng)加模板(ban)體積。
③反(fan)應(ying)體系(xi)未充(chong)分(fen)混(hun)勻：上機檢測前將反(fan)應(ying)體系(xi)充分(fen)混(hun)勻後再離(li)心(xin)。

染料法(fa)qPCRMix 熒光(guang)定量