諾(nuo)博(bo)萊(lai)德 無內毒素(su)質粒小(xiao)提(ti)試(shi)劑盒(he)  核(he)酸提(ti)取

EndoFree Plasmid Mini Kit無內毒素(su)質粒小(xiao)量(liang)快(kuai)速提(ti)試(shi)劑盒(he)

目(mu)錄(lu)號(hao)：31014

產(chan)品(pin)內容(rong):

保存條件(jian):

在室(shi)溫(wen)(15 ~ 25℃)幹燥條件(jian)下，可(ke)保存 12 個月(yue)。

RNase  A、內毒素(su)清(qing)除(chu)劑(ji)，可(ke)常溫運(yun)輸(shu)，-20℃保存。

產(chan)品(pin)簡介:

無內毒素(su)質粒小(xiao)提(ti)試(shi)劑盒(he)采(cai)用改進的(de)SDS-堿(jian)裂解法裂解細胞，通過(guo)獨te的(de)內毒素(su)清(qing)除(chu)劑(ji)選(xuan)擇(ze)性結合離心除(chu)去內毒素(su)，然後離心吸附(fu)柱(zhu)內的(de)矽基質膜在高(gao)鹽、低(di)pH值(zhi)狀(zhuang)態下選(xuan)擇(ze)性地結(jie)合溶液中(zhong)的(de)質粒DNA，再通過(guo)去蛋白(bai)液和漂洗液將(jiang)雜(za)質和其它細(xi)菌(jun)成分去除(chu)，最(zui)後(hou)低(di)鹽、高(gao)pH值(zhi)的(de)洗(xi)脫(tuo)緩沖(chong)液將(jiang)純凈(jing)質粒DNA從矽基質膜上洗脫(tuo)。所(suo)得質粒可直接(jie)用於酶切、轉(zhuan)化、PCR、RT-qPCR、測(ce)序及轉(zhuan)染(ran)等(deng)分子(zi)生物學實驗。

具(ju)體(ti)產(chan)品(pin)的(de)參數以(yi)收(shou)到產(chan)品(pin)說(shuo)明(ming)書(shu)的(de)參數為(wei)準(zhun)

產(chan)品(pin)特(te)點:

1.         獨te工(gong)藝(yi)配(pei)方(fang)清(qing)除(chu)內毒素(su)，內毒素(su)含量(liang)極(ji)低(di)（< 0.1 EU/ug DNA），細(xi)胞(bao)轉(zhuan)染(ran)效(xiao)果(guo)極(ji)jia。

2.         得(de)率(lv)高(gao)：1.5 - 4.5ml 菌(jun)液可提(ti)出多達 20 - 50 ug 的(de)純(chun)凈(jing)質粒；

重要(yao)提(ti)示：

壹(yi)、使用前請先檢查(zha)平(ping)衡(heng)液、溶液 P2 和溶液 N3 是(shi)否(fou)出現(xian)渾(hun)濁(zhuo)，如有(you)混(hun)濁(zhuo)現(xian)象，可(ke)在 37℃

水浴中(zhong)加熱幾分鐘，即可(ke)恢復(fu)澄(cheng)清(qing)。

二、第(di)壹(yi)次使用前，請先在去蛋白(bai)液 PE、漂(piao)洗(xi)液 WB 中(zhong)加入(ru)無水乙(yi)醇(chun)，請參照瓶(ping)上(shang)的(de)標(biao)簽。三(san)、首(shou)ci使用時請先將(jiang) RNase A 全(quan)部(bu)加到(dao)溶液 P1 中(zhong)，混(hun)勻(yun)，每次使用後置於(yu) 2 ~ 8℃保存。

操作步(bu)驟：

1.  柱(zhu)平(ping)衡(heng)：向(xiang)吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)（吸附(fu)柱(zhu)放(fang)入收集管中(zhong)）加入(ru) 100 ul 的(de)平(ping)衡(heng)液，12,000 rpm 離心 1 min，棄(qi)收(shou)集管中(zhong)濾液，將(jiang)吸附(fu)柱(zhu)重新放(fang)回收集管中(zhong)。

2.   取 1 ~ 5 ml 過(guo)夜(ye)培(pei)養的(de)菌(jun)液，室(shi)溫(wen) 12,000 rpm 離心 30 sec，盡(jin)量(liang)倒(dao)幹上清(qing)，收(shou)集菌(jun)體(ti)。

（註(zhu)意(yi)：根(gen)據菌(jun)液的(de)濃(nong)度(du)決(jue)定(ding)取液量，濃(nong)度高(gao)時取 1.5 ml 菌(jun)液離心即可(ke)，濃(nong)度(du)低(di)時可(ke)多收集壹(yi)次）

3.  加入(ru) 250 ul 溶液P1，重懸菌(jun)體(ti)沈(chen)澱(dian)，渦(wo)旋震蕩(dang)至(zhi)徹di懸浮。

（註(zhu)意(yi)：如有(you)未徹di懸浮的(de)菌(jun)塊(kuai)會(hui)影(ying)響裂解，導致(zhi)提(ti)取的(de)質粒濃度及(ji)純(chun)度(du)降(jiang)低(di)）

4.  加入(ru) 250 ul 溶液P2，溫(wen)和地上下翻(fan)轉(zhuan) 6-8 次，使菌(jun)體(ti)充(chong)分(fen)裂解，室(shi)溫(wen)放(fang)置 4 min。

（註(zhu)意(yi)：不(bu)可劇(ju)烈震蕩(dang)，以(yi)免(mian)造成基因組(zu) DNA 片(pian)段(duan)的(de)汙(wu)染(ran)，所(suo)用時間不(bu)要(yao)超過(guo) 5 min，以(yi)免(mian)質粒受(shou)到破壞，如未完(wan)quan變(bian)得(de)清(qing)亮(liang)，可能是(shi)菌(jun)體(ti)太(tai)多(duo)，可(ke)增(zeng)加溶液 P2 的(de)用量，在後(hou)續的(de)操作中(zhong)溶液 P3 的(de)用量(liang)也(ye)要(yao)相應增加）

5. 加入(ru) 250 ul 溶液 N3，立(li)即(ji)溫(wen)和地上下翻(fan)轉(zhuan) 6-8 次，充(chong)分混(hun)勻(yun)時會(hui)出現(xian)白(bai)色(se)絮(xu)狀(zhuang)沈澱(dian)，然後室(shi)溫(wen) 13,000 rpm 離心 10 min，小(xiao)心(xin)取上(shang)清(qing)至(zhi)新管，避免(mian)吸到(dao)白(bai)色(se)漂浮物。

（註(zhu)意(yi)：加入(ru)溶液 P3 後(hou)應立(li)即(ji)混(hun)合，避免(mian)產(chan)生(sheng) SDS 的(de)局(ju)部(bu)沈(chen)澱(dian)）

6.  加入(ru) 0.1 體(ti)積 (上(shang)清(qing)的(de)體(ti)積的(de) 10%，約(yue) 80 ul) 的(de)內毒素(su)清(qing)除(chu)劑(ji)到(dao)上壹(yi)步(bu)所(suo)得上清(qing)，顛(dian)倒(dao)旋(xuan)轉(zhuan)混(hun)勻(yun)，冰浴或者插入(ru)碎(sui)冰(bing)中(zhong)(或冰(bing)箱(xiang)冷(leng)凍(dong)室(shi))放(fang)置 5 分(fen)鐘，直到(dao)渾(hun)濁(zhuo)變(bian)清(qing)亮(liang)透明(ming)（或仍(reng)舊(jiu)稍(shao)有(you)渾(hun)濁(zhuo)），中(zhong)間偶爾混(hun)勻(yun)幾次。

（註(zhu)意(yi)：內毒素(su)清(qing)除(chu)劑(ji)加入(ru)上(shang)清(qing)後(hou)，上(shang)清(qing)會(hui)變(bian)得(de)渾(hun)濁(zhuo)，但是冰浴後應恢復(fu)清(qing)亮(liang),或稍(shao)渾(hun)濁(zhuo)。）

7. 常溫放(fang)置 3 ~ 5 分(fen)鐘，溫度(du)恢復(fu)室(shi)溫(wen)溶液很快(kuai)變(bian)為(wei)渾(hun)濁(zhuo)，顛倒(dao)混(hun)勻(yun)。（37℃可(ke)加速渾(hun)濁(zhuo)）

8. 室(shi)溫(wen) 15,000 rpm 離心 10 分(fen)鐘分相 。上層水相含 DNA，下層藍色(se)油(you)狀(zhuang)相含內毒素(su)和其它雜(za)質。將(jiang)含 DNA 的(de)上(shang)層水相轉(zhuan)移(yi)到(dao)新管（註意(yi)不(bu)要(yao)吸到(dao)藍色(se)油(you)狀(zhuang)層，裏(li)面(mian)含(han)內毒素(su)等(deng)雜(za)質），棄(qi)油(you)狀(zhuang)層。

9.向(xiang)上(shang)層水相中(zhong)加入(ru) 0.5 體(ti)積異(yi)丙醇(chun)（約(yue) 370 ul），充(chong)分(fen)顛(dian)倒(dao)混(hun)勻(yun)，分兩(liang)次（每(mei)次不(bu)超過(guo)700 ul）轉(zhuan)入(ru)吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)（吸附(fu)柱(zhu)放(fang)入收集管中(zhong)），12,000 rpm 離心 1min，質粒被吸附(fu)在膜(mo)上，倒(dao)掉(diao)收集管中(zhong)的(de)濾(lv)液，直到(dao)所(suo)有(you)混(hun)合溶液通過(guo)此(ci)吸附(fu)柱(zhu)。

10.      可(ke)選(xuan)步(bu)驟：向(xiang)吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)加入(ru) 500 ul 去蛋白(bai)液 PE，室(shi)溫(wen) 12,000 rpm 離心 30 sec，棄(qi)濾(lv)液。

（註(zhu)意(yi)：去蛋白(bai)液 PE 為濃(nong)縮液，按(an)要(yao)求(qiu)加入(ru)無水乙(yi)醇(chun)，用後應立(li)即(ji)蓋緊(jin)瓶(ping)蓋，以(yi)防(fang)酒(jiu)精(jing)揮(hui)發(fa)）

（註(zhu)意(yi)：如果(guo)宿主(zhu)菌(jun)是(shi) endA-，如 DH5α ，此(ci)步(bu)驟可(ke)省略。如果(guo)宿主(zhu)菌(jun)是(shi) endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等(deng)，此(ci)步(bu)驟不(bu)可省(sheng)略，因這(zhe)些(xie)宿主(zhu)菌(jun)含(han)有(you)大量的(de)核(he)酸酶，易(yi)降(jiang)解質粒。如果(guo)提(ti)取低(di)拷(kao)貝(bei)質粒也推薦(jian)采(cai)用此(ci)步(bu)驟）

11.        加入(ru) 600 ul 漂(piao)洗(xi)液 WB，室(shi)溫(wen) 12,000 rpm 離心 30 sec，棄(qi)濾(lv)液。

（註(zhu)意(yi)：漂(piao)洗液 WB 為濃(nong)縮液，按(an)要(yao)求(qiu)加入(ru)無水乙(yi)醇(chun)，用後應立(li)即(ji)蓋緊(jin)瓶(ping)蓋，以(yi)防(fang)酒(jiu)精(jing)揮(hui)發(fa)）

12.       重復(fu)步(bu)驟 11 壹(yi)次。

13.        室(shi)溫(wen) 12,000 rpm 離心 2 min，甩幹殘留液體(ti)，以(yi)免(mian)殘留乙(yi)醇(chun)抑制下遊(you)反(fan)應。

14.      將(jiang)吸附(fu)柱(zhu)置於(yu)壹(yi)個新的(de) 1.5 ml 離心管（自(zi)備(bei)）中(zhong)，加入(ru) 50 ~ 100 ul 的(de)洗(xi)脫(tuo)緩沖(chong)液 EB，室(shi)溫(wen)放(fang)置 2 min，12,000 rpm 離心 1 min，離心管底溶液即質粒 DNA。

（註(zhu)意(yi)：事(shi)先在 65~70℃水浴中(zhong)預熱洗(xi)脫(tuo)緩沖(chong)液 EB，可增(zeng)加洗(xi)脫(tuo)效(xiao)率(lv)；

如果(guo)需(xu)要(yao)較(jiao)多(duo)量質粒，可將(jiang)得到(dao)的(de)溶液重新加入(ru)吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)，再次離心 1 min 收(shou)集；如需(xu)使用去離子水洗(xi)脫，可用 NaOH 調(tiao)整(zheng)其(qi) pH 值(zhi)在 7.0 - 8.5 之(zhi)間。）

無內毒素(su)質粒小(xiao)提(ti)試(shi)劑盒(he)  核(he)酸提(ti)取