諾博萊(lai)德 酵母(mu)高(gao)純(chun)質(zhi)粒(li)小(xiao)提(ti)試劑盒 核酸提(ti)取(qu)

HiPure Yeast Plasmid Mini Kit酵母(mu)高(gao)純(chun)度(du)質(zhi)粒(li)小(xiao)量(liang)快速提(ti)試劑盒

目錄號：31016

產品內容(rong)：

保存(cun)條(tiao)件(jian)：

在室(shi)溫(wen)(15~25℃)幹(gan)燥(zao)條(tiao)件(jian)下(xia)，可(ke)保存(cun)12個(ge)月。加(jia)入 RNase A後的(de)溶液(ye) P1 應置於(yu) 2 ~ 8℃保存(cun)，可穩(wen)定保存(cun)6 個(ge)月,如(ru)果(guo) P1 中(zhong) RNase A 失活(huo)，重新(xin)補(bu)加(jia)即可。

具體(ti)產品的(de)參(can)數以收(shou)到(dao)產品說明書(shu)的(de)參(can)數為(wei)準(zhun)

產品簡介(jie)：

本試劑盒用於(yu)高(gao)純(chun)度(du)酵母(mu)質(zhi)粒(li) DNA 的(de)小(xiao)量(liang)制備(bei)。菌(jun)體(ti)經堿裂解(jie)、高(gao)鹽(yan)、低(di) pH 處理，質(zhi)粒(li)可從(cong)菌(jun)體(ti)中(zhong)釋放出來，並特異、高(gao)效(xiao)地被離(li)心(xin)吸附(fu)柱(zhu)吸(xi)附。通過(guo)清(qing)洗(xi)液(ye)的(de)洗(xi)滌(di)可去(qu)除雜質(zhi)，在低(di)鹽(yan)、高(gao) pH 條(tiao)件(jian)下(xia)洗(xi)脫(tuo)，最(zui)後得(de)到(dao)純度較高(gao)的(de)質(zhi)粒(li) DNA。所(suo)得(de)質(zhi)粒(li)可直(zhi)接用於(yu)酶切(qie)、轉化(hua)、PCR、RT-qPCR、測序及轉(zhuan)染(ran)等分子生物學(xue)實(shi)驗。

註意事(shi)項(xiang)：

1.   通常酵母(mu)的(de)拷(kao)貝(bei)數(shu)都(dou)很(hen)低(di)，高(gao)拷(kao)貝(bei)最(zui)大得(de)率壹(yi)般(ban)為每(mei) 5 ml 培養物提取(qu) 1μg 左(zuo)右的(de)質(zhi)粒(li)。用於(yu)下遊試驗(yan)時通常建(jian)議(yi)使(shi)用量(liang)為： 1-5μl 用做 PCR 模板(ban);5-10μl 用於(yu)轉化(hua)大腸桿菌(jun),選擇高(gao)效(xiao)率(lv)的(de)感(gan)受態細(xi)胞(bao)。

2.   用戶(hu)需要自(zi)備(bei) Sorbitol buffer( 1M 山li醇，0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇(chun))。配制方法：在 600 ml 去(qu)離(li)子水(shui)裏(li)面(mian)溶解(jie)182.2克山li醇(chun)，加(jia)入(ru)200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不(bu)需要調(tiao)節 PH 值(zhi)，定容到(dao) 1L，4℃保存(cun)。臨(lin)用(yong)前(qian)加 0.1%β-巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇(chun)(商(shang)品化(hua)的(de) β-巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇(chun)摩(mo)爾(er)濃度壹(yi)般(ban)為 14M)。

3.   使用前(qian)請先檢查(zha)平(ping)衡(heng)液(ye)、溶液(ye) YP2 和溶液(ye) YP3 是否(fou)出現渾(hun)濁，如(ru)有(you)混(hun)濁現(xian)象(xiang)，可(ke)在 37℃水(shui)浴(yu)中(zhong)加熱(re)幾(ji)分鐘(zhong)，即可(ke)恢復澄清(qing)。 
      4.   溶液(ye)YP1，YP2 和YP3 的(de)用(yong)量(liang)比例，若細(xi)菌(jun)量(liang)增大，需按比(bi)例放大(da)這(zhe)些(xie)溶液(ye)的(de)使(shi)用量(liang)；重要提(ti)示(shi)：

壹、第壹(yi)次(ci)使(shi)用(yong)前(qian)請先漂洗(xi)液(ye) WB 中(zhong)加入無水(shui)乙(yi)醇(chun)（詳見瓶身(shen)標簽(qian)），混勻，並做好(hao)標記(ji)。
       二、首ci使(shi)用(yong)時(shi)請先將 RNase A 全部(bu)加(jia)到(dao)溶液(ye) YP1 中(zhong)，混勻，每(mei)次使用(yong)後(hou)置於(yu) 2 ~ 8℃保存(cun)。
      三、吸取(qu)使用(yong)量(liang)的(de)Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇(chun)，回(hui)復到(dao)室溫(wen)備(bei)用(yong)。

操(cao)作步驟(zhou)：

1.取(qu) 1.5-5 毫升酵母(mu)培(pei)養物(不(bu)超(chao)過(guo) 5x 107 cells)，9,000rpm 離(li)心(xin) 30 秒，盡(jin)可能(neng)的(de)吸(xi)棄(qi)上(shang)清(qing)，收(shou)集(ji)菌(jun)體(ti)。

（註意： 如(ru)果(guo)用 50ml 離(li)心(xin)管收(shou)集(ji)菌(jun)體(ti)，可以離(li)心(xin)棄(qi)上(shang)清(qing)後，在同(tong)壹(yi)管內加(jia)入(ru)更多(duo)的(de)菌(jun)液(ye)，重復步驟(zhou) 1，直(zhi)到(dao)收(shou)集(ji)到(dao)足夠(gou)多(duo)的(de)菌(jun)體(ti)）

2.    加入 600μl Sorbitol buffer，輕(qing)柔(rou)吹(chui)打(da)充(chong)分重懸(xuan)細(xi)胞(bao)；可按照(zhao) 20-50U/1x107 cells 的(de)比(bi)例加入 Lyticase(壹般(ban) 5 ml 培養物可能(neng)需要加(jia)到(dao) 200U)，充(chong)分顛倒(dao)混勻，37℃溫(wen)育(yu)至(zhi)少(shao) 30分鐘(zhong)消化(hua)細(xi)胞(bao)壁(bi)，中(zhong)間可顛倒數次幫助消(xiao)化(hua)。

（註意：如(ru)果(guo)破壁(bi)效果(guo)不(bu)好導(dao)致質(zhi)粒(li)產量(liang)低，可以加(jia)大(da) lyicase 用量(liang)來提高(gao)酶(mei)工(gong)作濃(nong)度(du)，還(hai)可以延(yan)長消化(hua)時間來提(ti)高(gao)效(xiao)果(guo)，不(bu)適合 Lyticase 消化(hua)的(de)酵母(mu)可(ke)選用 Zymolase 或者其它方法如(ru)玻(bo)璃(li)珠(zhu)渦旋，反(fan)復凍(dong)融(rong)等。）

3.   13,000rpm 離(li)心(xin) 1 min，盡可能(neng)吸(xi)棄(qi)上(shang)清(qing)，加入(ru) 250 ul 溶液(ye)YP1，重懸菌(jun)體(ti)沈澱，渦旋(xuan)震(zhen)蕩(dang)至(zhi)徹(che)di懸(xuan)浮。

（註意：如(ru)有(you)未徹(che)di懸(xuan)浮的(de)菌(jun)塊會(hui)影響(xiang)裂解(jie)，導(dao)致(zhi)提(ti)取(qu)的(de)質(zhi)粒(li)濃度(du)及純度降低）

4.  加入 250 ul 溶液(ye)YP2，溫(wen)和(he)地上下翻轉(zhuan) 6-8 次，使菌(jun)體(ti)充(chong)分裂解(jie)，室(shi)溫(wen)放(fang)置 4 min。

（註意：不(bu)可劇(ju)烈震(zhen)蕩(dang)，以免(mian)造成(cheng)基(ji)因組 DNA 片(pian)段的(de)汙染(ran)，所(suo)用時間(jian)不(bu)要超(chao)過(guo) 5 min，以免(mian)質(zhi)粒(li)受到(dao)破壞(huai)，如(ru)未完(wan)quan變(bian)得(de)清(qing)亮(liang)，可能(neng)是(shi)菌(jun)體(ti)太(tai)多(duo)，可(ke)增加溶液(ye) P2 的(de)用(yong)量(liang)，在後(hou)續(xu)的(de)操(cao)作中(zhong)溶液(ye) YP3 的(de)用量(liang)也要相(xiang)應增加）

5.加入 350 ul 溶液(ye) YP3，立即(ji)溫(wen)和(he)地上下翻轉(zhuan) 6-8 次，充(chong)分混勻時會(hui)出現白色絮(xu)狀(zhuang)沈澱，

然後室(shi)溫(wen) 13,000 rpm 離(li)心(xin) 10 min。

（註意：加(jia)入溶液(ye) YP3 後應立即(ji)混(hun)合，避(bi)免(mian)產(chan)生 SDS 的(de)局(ju)部(bu)沈(chen)澱）

6.   將上清(qing)液(ye)轉移到(dao)吸附柱(zhu)中(zhong)，室溫(wen) 12,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，質(zhi)粒(li)被吸(xi)附在膜上，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

7.    可選步驟(zhou)：向吸(xi)附(fu)柱(zhu)中(zhong)加入 500 ul 去(qu)蛋(dan)白液(ye) PE，室溫(wen) 12,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

（註意：去(qu)蛋(dan)白液(ye) PE 為濃縮液(ye)，按要(yao)求加入無水(shui)乙(yi)醇(chun)，用(yong)後(hou)應立即(ji)蓋(gai)緊瓶(ping)蓋，以防(fang)酒精揮發）

（註意：如(ru)果(guo)宿主(zhu)菌(jun)是(shi) endA-，如(ru) DH5α，此步驟(zhou)可(ke)省(sheng)略。如(ru)果(guo)宿主(zhu)菌(jun)是(shi) endA+，如(ru) TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步驟(zhou)不(bu)可省(sheng)略，因(yin)這(zhe)些(xie)宿主(zhu)菌(jun)含(han)有(you)大(da)量(liang)的(de)核(he)酸酶(mei)，易降解(jie)質(zhi)粒(li)。如(ru)果(guo)提取(qu)低拷(kao)貝(bei)質(zhi)粒(li)也推(tui)薦采用此步驟(zhou)）

8.加入 600 ul 漂洗(xi)液(ye) WB，室溫(wen) 12,000 rpm 離(li)心(xin) 30 sec，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

（註意：漂洗(xi)液(ye) WB 為濃縮液(ye)，按要(yao)求加入無水(shui)乙(yi)醇(chun)，用(yong)後(hou)應立即(ji)蓋(gai)緊瓶(ping)蓋，以防(fang)酒精揮發）

9.    重復步驟(zhou) 8 壹次。

10.   室溫(wen) 12,000 rpm 離(li)心(xin) 2 min，甩幹(gan)殘留液(ye)體(ti)。

（註意：此(ci)步不(bu)能省(sheng)略，否(fou)則殘留乙(yi)醇(chun)會(hui)影響(xiang)質(zhi)粒(li)的(de)後(hou)續使(shi)用）

11. 將吸附(fu)柱(zhu)置於(yu)壹個(ge)新(xin)的(de) 1.5 ml 離(li)心(xin)管（自(zi)備(bei)）中(zhong)，加入 50 ~ 100 ul 的(de)洗(xi)脫(tuo)緩(huan)沖(chong)液(ye) EB，室溫(wen)放(fang)置 2 min，12,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，離(li)心(xin)管底(di)溶液(ye)即質(zhi)粒(li) DNA。

（註意：事(shi)先在 65~70℃水(shui)浴(yu)中(zhong)預熱(re)洗(xi)脫(tuo)緩(huan)沖(chong)液(ye) EB，可增加洗(xi)脫(tuo)效(xiao)率；如(ru)果(guo)需要較多(duo)量(liang)質(zhi)粒(li)，可將(jiang)得(de)到(dao)的(de)溶液(ye)重新加入吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)，再次離(li)心(xin) 1 min 收(shou)集(ji)；如(ru)需使用(yong)去(qu)離(li)子水(shui)洗(xi)脫(tuo)，可(ke)用 NaOH 調整其 pH 值(zhi)在 7.0 - 8.5 之間。）

酵母(mu)高(gao)純(chun)質(zhi)粒(li)小(xiao)提(ti)試劑盒 核酸提(ti)取(qu)