諾博萊德(de) 無(wu)內(nei)毒素(su)質(zhi)粒小(xiao)提(ti)中(zhong)量提(ti)取試劑盒 核酸(suan)提(ti)取

EndoFree Plasmid Midi Kit無(wu)內(nei)毒素(su)質(zhi)粒小(xiao)提(ti)中(zhong)量快(kuai)速(su)提(ti)試劑盒

目錄(lu)號：31110

產品(pin)內容(rong):

保(bao)存(cun)條(tiao)件:

在室(shi)溫(15~25℃)幹(gan)燥(zao)條件下(xia)，可(ke)保(bao)存(cun)12個月(yue)。

RNaseA、內(nei)毒素(su)清除(chu)劑，可常(chang)溫運(yun)輸(shu)，-20℃保存。

產品(pin)簡(jian)介(jie)：

無(wu)內(nei)毒素(su)質(zhi)粒小(xiao)提(ti)中(zhong)量試劑盒可提(ti)取5-15ml菌(jun)液，采用改進的SDS-堿裂解法裂解細胞(bao)，通過(guo)獨te的內毒素(su)清除(chu)劑選(xuan)擇(ze)性結合(he)離(li)心(xin)除(chu)去(qu)內(nei)毒素(su)，然(ran)後(hou)離(li)心(xin)吸(xi)附柱內(nei)的矽基質(zhi)膜在高(gao)鹽(yan)、低(di)pH值(zhi)狀(zhuang)態(tai)下(xia)選(xuan)擇(ze)性地結合(he)溶液中(zhong)的質(zhi)粒DNA，再(zai)通過(guo)去蛋白(bai)液和漂洗(xi)液將雜(za)質(zhi)和其它細菌(jun)成(cheng)分(fen)去(qu)除(chu)，最(zui)後(hou)低(di)鹽、高(gao)pH值(zhi)的洗(xi)脫緩(huan)沖液將純(chun)凈(jing)質(zhi)粒DNA從(cong)矽基(ji)質(zhi)膜上(shang)洗(xi)脫(tuo)。所(suo)得(de)質(zhi)粒可(ke)直(zhi)接用(yong)於酶切(qie)、轉化(hua)、PCR、RT-qPCR、測序及(ji)轉(zhuan)染(ran)等(deng)分(fen)子(zi)生(sheng)物學(xue)實驗(yan)。

具(ju)體產品(pin)的參(can)數以收(shou)到(dao)產品(pin)說明(ming)書(shu)的參(can)數為(wei)準(zhun)

產品(pin)特點(dian):

1.         獨te工藝(yi)配(pei)方清除(chu)內(nei)毒素(su)，內(nei)毒素(su)含(han)量極(ji)低(di)（<0.1 EU/ug DNA），細胞(bao)轉(zhuan)染(ran)效(xiao)果(guo)極(ji)jia。

2.         得(de)率(lv)高(gao)：5–15ml 菌(jun)液可提(ti)出多達(da)30–90 ug 的純凈質(zhi)粒。

重(zhong)要提(ti)示(shi)：

壹(yi)、使用(yong)前請先(xian)檢(jian)查(zha)平(ping)衡液、溶液 P2 和溶液 N3 是(shi)否出現渾(hun)濁(zhuo)，如有(you)混(hun)濁(zhuo)現象(xiang)，可在 37℃

水(shui)浴(yu)中(zhong)加熱幾分(fen)鐘(zhong)，即(ji)可恢(hui)復澄清。

二、首(shou)ci使用(yong)前請先(xian)在去(qu)蛋白(bai)液 PE、漂洗(xi)液 WB 中(zhong)加入無(wu)水(shui)乙(yi)醇（詳見瓶身(shen)的標簽），混(hun)勻(yun)。

三、首(shou)ci使用(yong)時(shi)請先(xian)將(jiang) RNase A 全(quan)部加到(dao)溶(rong)液 P1 中(zhong)，混(hun)勻(yun)，每次使用(yong)後(hou)置(zhi)於 2 ~ 8℃保(bao)存(cun)。

操(cao)作步驟(zhou)：

1.         柱(zhu)平(ping)衡：向(xiang)吸(xi)附柱中(zhong)（吸附柱放(fang)入(ru)收(shou)集管(guan)中(zhong)）加入 100 ul 的平(ping)衡液，12,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，棄(qi)收(shou)集管(guan)中(zhong)濾液，將吸(xi)附柱重(zhong)新(xin)放(fang)回收(shou)集管(guan)中(zhong)。

2.   取 5 ~ 15 ml 過(guo)夜培(pei)養的菌(jun)液，室(shi)溫 9,000 rpm 離(li)心(xin) 2 min，盡(jin)量(liang)倒幹(gan)上(shang)清，收(shou)集菌(jun)體。

（註(zhu)意(yi)：根(gen)據菌(jun)液的濃度(du)決(jue)定(ding)取液量，濃(nong)度(du)高(gao)時(shi)取 5 ml 菌(jun)液離(li)心(xin)即(ji)可，濃度(du)低時(shi)可(ke)多(duo)收(shou)集壹次）

3.  加入 500 ul 溶(rong)液P1，重(zhong)懸(xuan)菌(jun)體沈(chen)澱(dian)，渦(wo)旋震蕩(dang)至徹(che)di懸浮(fu)。

（註(zhu)意(yi)：如有(you)未徹di懸(xuan)浮(fu)的菌(jun)塊(kuai)會影響(xiang)裂解，導致(zhi)提(ti)取的質(zhi)粒濃(nong)度(du)及(ji)純(chun)度(du)降低(di)）

4.  加入 500 ul 溶(rong)液P2，溫和地上(shang)下(xia)翻轉(zhuan) 6-8 次(ci)，使菌(jun)體充分(fen)裂解，室(shi)溫放(fang)置(zhi) 4 min。

（註(zhu)意(yi)：不(bu)可(ke)劇烈震蕩(dang)，以免造(zao)成(cheng)基(ji)因(yin)組(zu) DNA 片(pian)段(duan)的汙染(ran)，所(suo)用(yong)時(shi)間(jian)不(bu)要超過(guo) 5 min，以免質(zhi)粒受(shou)到(dao)破壞，如未完quan變得清亮(liang)，可(ke)能(neng)是(shi)菌(jun)體太(tai)多(duo)，可(ke)增加溶液 P2 的用量，在後(hou)續(xu)的操(cao)作中(zhong)溶液 P3 的用量(liang)也(ye)要相(xiang)應增加）

5. 加入 500 ul 溶(rong)液 N3，立即(ji)溫和地上(shang)下(xia)翻轉(zhuan) 6-8 次(ci)，充分(fen)混(hun)勻(yun)時(shi)會出現白(bai)色絮(xu)狀沈(chen)澱，

然(ran)後(hou)室(shi)溫 13,000 rpm 離(li)心(xin) 10 min，小(xiao)心(xin)取上(shang)清至新管(guan)，避免吸到(dao)白(bai)色漂浮(fu)物。

（註(zhu)意(yi)：加入溶液 P3 後(hou)應立即(ji)混(hun)合(he)，避免產生(sheng) SDS 的局部沈(chen)澱(dian)）

6.加入 0.1 體積(ji) (上(shang)清的體積(ji)的 10%，約(yue) 160 ul ) 的內毒素(su)清除(chu)劑到(dao)上(shang)壹步所(suo)得上(shang)清，顛(dian)倒旋轉混(hun)勻(yun)，冰浴或(huo)者插入(ru)碎(sui)冰中(zhong)(或(huo)冰箱(xiang)冷凍(dong)室(shi))放(fang)置(zhi) 5 分(fen)鐘(zhong)，直(zhi)到(dao)渾(hun)濁(zhuo)變清亮(liang)透明(ming)（或(huo)仍(reng)舊(jiu)稍有(you)渾(hun)濁(zhuo)），中(zhong)間(jian)偶爾混(hun)勻(yun)幾次。

（註(zhu)意(yi)：內(nei)毒素(su)清除(chu)劑加入上(shang)清後，上(shang)清會變得渾(hun)濁(zhuo)，但是(shi)冰浴後(hou)應恢(hui)復清亮(liang),或(huo)稍渾(hun)濁(zhuo)。）

7. 常(chang)溫放(fang)置(zhi) 3 ~ 5 分(fen)鐘(zhong)，溫度(du)恢(hui)復室(shi)溫溶(rong)液很快(kuai)變為渾(hun)濁(zhuo)，顛(dian)倒混(hun)勻(yun)。（37℃可(ke)加速渾濁(zhuo)）

8. 室(shi)溫 15,000 rpm 離(li)心(xin) 10 分(fen)鐘(zhong)分(fen)相(xiang) 。上(shang)層(ceng)水相(xiang)含 DNA，下(xia)層(ceng)藍(lan)色油狀相(xiang)含內毒素(su)和其它雜(za)質(zhi)。將含(han) DNA 的上(shang)層(ceng)水相(xiang)轉移到(dao)新(xin)管(guan)（註(zhu)意(yi)不(bu)要吸到(dao)藍(lan)色油狀層(ceng)，裏面(mian)含內(nei)毒素(su)等(deng)雜(za)質(zhi)），棄(qi)油狀(zhuang)層(ceng)。

9. 向(xiang)上(shang)層(ceng)水相(xiang)中(zhong)加入 0.5 倍(bei)體積(ji)的異丙醇（約(yue) 740 ul），充分(fen)顛(dian)倒混(hun)勻(yun)，分(fen)兩(liang)次(ci)（每次不(bu)超(chao)過(guo) 700 ul）轉(zhuan)入(ru)吸(xi)附柱中(zhong)（吸附柱放(fang)入(ru)收(shou)集管(guan)中(zhong)），12,000 rpm 離(li)心(xin) 1min，質(zhi)粒被(bei)吸(xi)附在膜(mo)上(shang)，倒掉收(shou)集管(guan)中(zhong)的濾液。直到(dao)所(suo)有(you)混(hun)合(he)溶液通過(guo)此吸附柱。

10.      可(ke)選(xuan)步驟：向吸附柱中(zhong)加入 500 ul 去(qu)蛋白(bai)液 PE，室(shi)溫 12,000 rpm 離(li)心(xin) 30 sec，棄(qi)濾液。

（註(zhu)意(yi)：去(qu)蛋白(bai)液 PE 為濃(nong)縮(suo)液，按(an)要求(qiu)加入無(wu)水(shui)乙(yi)醇，用(yong)後(hou)應立即(ji)蓋緊(jin)瓶蓋，以防酒精(jing)揮發）

（註(zhu)意(yi)：如果宿(xiu)主(zhu)菌(jun)是(shi) endA-，如 DH5α，此(ci)步(bu)驟(zhou)可省(sheng)略(lve)。如果宿(xiu)主(zhu)菌(jun)是(shi) endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等(deng)，此(ci)步(bu)驟不(bu)可(ke)省略(lve)，因這些宿(xiu)主菌(jun)含(han)有(you)大(da)量的核酸(suan)酶(mei)，易降(jiang)解質(zhi)粒。如果提(ti)取低拷貝質(zhi)粒也(ye)推(tui)薦采用此(ci)步(bu)驟）

11.        加入 600 ul 漂洗(xi)液 WB，室(shi)溫 12,000 rpm 離(li)心(xin) 30 sec，棄(qi)濾液。

（註(zhu)意(yi)：漂洗(xi)液 WB 為濃(nong)縮(suo)液，按(an)要求(qiu)加入無(wu)水(shui)乙(yi)醇，用(yong)後(hou)應立即(ji)蓋緊(jin)瓶蓋，以防酒精(jing)揮發）

12.       重(zhong)復步驟(zhou) 11 壹(yi)次(ci)。

13.        室(shi)溫 12,000 rpm 離(li)心(xin) 2 min，甩(shuai)幹(gan)殘(can)留(liu)液體，以免殘(can)留(liu)乙(yi)醇抑制(zhi)下(xia)遊(you)反應。

14.      將(jiang)吸(xi)附柱置(zhi)於壹個新(xin)的 1.5 ml 離(li)心(xin)管(guan)（自備(bei)）中(zhong)，加入 100 ~ 200 ul 的洗(xi)脫緩(huan)沖液 EB，室(shi)溫放(fang)置(zhi) 2 min，12,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，離(li)心(xin)管(guan)底溶(rong)液即質(zhi)粒 DNA。

（註(zhu)意(yi)：事先在 65~70℃水(shui)浴(yu)中(zhong)預熱洗(xi)脫緩(huan)沖液 EB，可增加洗(xi)脫效率；

如果需要較多(duo)量質(zhi)粒，可(ke)將(jiang)得到(dao)的溶液重新(xin)加入吸附柱中(zhong)，再(zai)次(ci)離(li)心(xin) 1 min 收(shou)集；如需使用(yong)去(qu)離(li)子(zi)水洗(xi)脫，可用 NaOH 調(tiao)整(zheng)其 pH 值(zhi)在 7.0 - 8.5 之(zhi)間(jian)。）

無(wu)內(nei)毒素(su)質(zhi)粒小(xiao)提(ti)中(zhong)量提(ti)取試劑盒 核酸(suan)提(ti)取