諾博(bo)萊(lai)德 無(wu)內(nei)毒(du)素質(zhi)粒中(zhong)量提取試劑盒 核(he)酸提取

EndoFree Plasmid Midi Kit無內(nei)毒(du)素質(zhi)粒中(zhong)量提試劑盒(he)（溶液(ye)型(xing)）

目錄號(hao)：31018

產品(pin)內(nei)容：

保(bao)存條件(jian)：

在(zai)室溫(wen) (15 ~ 25℃) 條件下(xia)，可(ke)保(bao)存 12 個月。

RNaseA、內(nei)毒(du)素清除(chu)劑，可(ke)常(chang)溫(wen)運(yun)輸，-20℃保(bao)存。

適用範(fan)圍(wei)：

特別(bie)適合(he)用於中(zhong)量轉(zhuan)染(ran)級(ji)質(zhi)粒的(de)制備(bei)，以及BAC/PAC 等大型(xing)質(zhi)粒的(de)制備(bei)。

具體(ti)產品(pin)的參(can)數以收到(dao)產品(pin)說明(ming)書的參(can)數為(wei)準

產品(pin)簡(jian)介(jie)：

采用獨te的溶液(ye)配方(fang)和內(nei)毒(du)素清除(chu)試劑(ji)，只(zhi)需(xu)要幾(ji)次(ci)簡(jian)單的離(li)心，就可以去(qu)除(chu)蛋(dan)白(bai)質、多糖(tang)、內(nei)毒(du)素、RNA 等雜(za)質，獲(huo)得(de)高質(zhi)量的轉(zhuan)染(ran)級(ji)質(zhi)粒 DNA，可直接(jie)應用於細(xi)胞(bao)轉(zhuan)染(ran)甚至動(dong)物(wu)體(ti)內(nei)實(shi)驗(yan)等對 DNA 純度(du)要求(qiu)很(hen)高的(de)工(gong)作(zuo)中(zhong)。

本方(fang)法(fa)提(ti)取純化質粒 DNA，對(dui)質粒損(sun)傷小(xiao)，即使(shi)是(shi) 10kb 甚至 100kb 以上的(de)大(da)型質粒或超(chao)大型(xing) BAC/PAC 質粒，都(dou)可以(yi)有(you)效(xiao)純(chun)化(hua)。獲(huo)得(de)的質(zhi)粒產量(liang)高，濃度(du)可(ke)高達(da) 5ug /ul，超(chao)螺旋(xuan)比(bi)例可高達(da) 95%，內(nei)毒(du)素<0.1 EU/ug，細(xi)胞(bao)轉(zhuan)染(ran)效(xiao)果(guo)極(ji)jia。

重要提(ti)示：

壹(yi)、環(huan)境(jing)溫(wen)度(du)低時溶液(ye) P2 中(zhong) SDS 可能會析出(chu)出(chu)現渾(hun)濁(zhuo)或者(zhe)沈澱(dian)，可(ke)在(zai) 37℃水(shui)浴(yu)加(jia)熱(re)幾(ji)分(fen)鐘，即可(ke)恢復澄(cheng)清，不(bu)要劇(ju)烈搖晃(huang)，以免(mian)形(xing)成過(guo)量的(de)泡(pao)沫。

二、提(ti)取大質粒時, 操作(zuo)動(dong)作(zuo)要輕(qing)柔(rou)，剪(jian)掉壹(yi)部(bu)分(fen)吸(xi)頭的(de)尖嘴，以增大開口，防止(zhi)機(ji)械剪(jian)切(qie)對 DNA 的損(sun)壞(huai)。

三、提取的質粒量(liang)與(yu)細菌培(pei)養(yang)濃度(du)、質(zhi)粒拷(kao)貝數(shu)等(deng)因素有(you)關(guan)。如果(guo)所(suo)提(ti)質(zhi)粒為(wei)低拷(kao)貝質(zhi)粒或大(da)於 10kb 的大質(zhi)粒，應(ying)加大(da)菌體(ti)使(shi)用量(liang)，同(tong)時按(an)比(bi)例增加 P1、P2、PIII 的(de)用量(liang)。

四、得到(dao)的質(zhi)粒 DNA 電泳時可能為(wei)單壹(yi)條(tiao)帶，也可(ke)能為(wei) 2 條或者(zhe)多條(tiao) DNA 條帶，這主(zhu)要是不同(tong)程(cheng)度(du)的(de)超(chao)螺旋(xuan)構(gou)象(xiang)質粒泳動(dong)位(wei)置不(bu)壹(yi)造成(cheng)，與(yu)提取物(wu)培養(yang)時間(jian)長(chang)短(duan)、提(ti)取時操作(zuo)劇烈程(cheng)度(du)等(deng)有(you)關(guan)。本(ben)公司(si)產品(pin)正常(chang)操(cao)作(zuo)情況下基本(ben)超(chao)螺旋(xuan)可以超(chao)過(guo) 95%。

五、首(shou)ci使(shi)用時請先(xian)將(jiang) RNase A 全(quan)部(bu)加(jia)到(dao)溶液(ye) P1 中(zhong)，混勻(yun)，每次(ci)使(shi)用後(hou)置(zhi)於 2 ~ 8℃保(bao)存。

操作(zuo)步驟(zhou)：

1.  取 40-60 ml（最(zui)多 90ml）過(guo)夜(ye)培(pei)養(yang)的菌液(ye)，裝(zhuang)入(ru) 50ml 離(li)心管中(zhong)，12,000 x g 於 4℃離(li)心2 min，盡量倒(dao)幹上清，收集菌體(ti)。

（註意(yi)： 如果(guo)需(xu)要收集更(geng)多的(de)菌體(ti)，離(li)心棄上(shang)清後(hou)，在(zai)同壹(yi)管內(nei)加入(ru)更(geng)多的(de)菌液(ye)，重復步驟(zhou) 1，直到(dao)收集到(dao)足(zu)夠(gou)多的(de)菌體(ti)）

2. 加入(ru) 2.5 ml 溶液(ye) P1，重懸(xuan)菌體(ti)沈澱(dian)，渦(wo)旋(xuan)震蕩至徹di懸浮, 室溫放(fang)置(zhi) 3 ~ 5 分鐘。

（註意(yi)：如有(you)未(wei)徹di懸浮的菌塊(kuai)會影(ying)響裂(lie)解，導致(zhi)提(ti)取的質粒濃度(du)及純度(du)降(jiang)低）

3.  加入(ru) 2.5 ml 溶液(ye) P2，溫和地(di)上(shang)下翻轉(zhuan) 6-8 次，使(shi)菌體(ti)充分裂(lie)解，室溫(wen)放(fang)置 4 min。

（註意(yi)：不可(ke)劇(ju)烈震蕩，以(yi)免(mian)造成(cheng)基因組 DNA 片段的(de)汙染，所(suo)用時間(jian)不(bu)要超(chao)過(guo) 5 min，以免質(zhi)粒受到(dao)破(po)壞，如未(wei)完(wan)quan變得清亮(liang)，可(ke)能是菌體(ti)太(tai)多，可(ke)增加溶液(ye) P2 的(de)用量(liang)，在(zai)後續(xu)的(de)操(cao)作(zuo)中(zhong)溶液(ye) P3 的(de)用量也要相應(ying)增加）

4. 加入(ru) 2.5 ml 溶液(ye)PIII，立(li)即溫和地(di)上(shang)下(xia)翻轉(zhuan) 6-8 次(ci)，充分混勻(yun)，至白(bai)色(se)絮狀物(wu)產生，然後 12,000 x g 於 4℃離(li)心 10 ~ 15 min, 小心取上清，移入(ru)新(xin)的(de) 50 ml 離(li)心管中(zhong)。

（註意(yi)：加入(ru)溶液(ye) P3 後應立(li)即(ji)混合(he)，避免(mian)產生 SDS 的局部(bu)沈澱(dian)）

5.  加入(ru) 5 ml 異丙(bing)醇，上(shang)下顛倒(dao)離(li)心管，充(chong)分(fen)混勻(yun)。

6. 在(zai) 4℃條件下(xia) 12,000~16,000 x g 離(li)心 10 min，小心棄去(qu)上(shang)清，倒(dao)置(zhi)輕輕(qing)瀝(li)幹殘(can)余(yu)液(ye)體(ti)，加入(ru) 3-5 ml 70%乙醇漂(piao)洗(xi)壹(yi)遍(bian)，最(zui)高速離(li)心 5 分鐘(zhong)，棄上(shang)清，晾(liang)幹沈澱(dian)。

（註意(yi)：DNA 沈澱(dian)如果(guo)幹燥過(guo)頭，DNA 將無法(fa)完(wan)quan溶解，但(dan)是(shi)如果(guo)乙(yi)醇沒有(you)晾(liang)幹揮(hui)發(fa)幹凈，殘(can)留(liu)太(tai)多，也會造成(cheng) DNA 無法(fa)完(wan)quan溶解。）

7.  加入(ru) 0.7 ml 溶液(ye)P1 完(wan)quan溶解沈澱(dian)團(tuan)塊，註(zhu)意(yi)附著在(zai)側壁(bi)上的(de)質粒沈澱(dian)雖(sui)然看(kan)不見(jian)，也要吹(chui)打側壁(bi)涮洗(xi)下來（大質(zhi)粒可(ke)用寬口吸(xi)管輕(qing)輕(qing)吹(chui)打輔助溶解）。然後(hou)將質(zhi)粒溶液(ye)轉(zhuan)入(ru)新(xin)的(de) 1.5 ml 離(li)心管中(zhong)。

8. 可選(xuan)步驟(zhou)（壹(yi)般(ban)不(bu)需要）：如果(guo)菌株(zhu) RNA 豐富有(you)微(wei)量(liang) RNA 殘(can)留(liu)，可在(zai)此(ci)步驟(zhou)後將(jiang)質(zhi)粒溶液(ye) 60℃孵育 15 min 消(xiao)化(hua) RNA。

9.每管加(jia)入(ru) 55 ul 雜(za)質清除(chu)液(ye) A，顛倒(dao)充(chong)分混勻(yun)後, 加入(ru)約(yue) 0.1 體(ti)積(ji) (約(yue) 80ul ) 冰(bing)預冷(leng)的內(nei)毒(du)素清除(chu)劑，顛倒(dao)旋(xuan)轉(zhuan) 7-10 次（30 秒(miao)左(zuo)右(you)）充分混勻(yun)，上清會變得渾(hun)濁，冰(bing)浴(yu)或者(zhe)冰(bing)上放(fang)置>=5 min，中(zhong)間(jian)偶(ou)爾顛倒(dao)混勻(yun)幾(ji)次(ci)，上清恢復清亮(liang)。

(註意(yi)：如果(guo)不(bu)需要去(qu)內(nei)毒(du)素用於轉(zhuan)染(ran)，可在(zai)此(ci)步驟(zhou)只(zhi)加(jia)入(ru) 55 ul 雜(za)質清除(chu)液(ye)A，充分混勻(yun)後冰(bing)上放(fang)置 5 分鐘，離(li)心後小(xiao)心取上清轉(zhuan)入(ru)壹(yi)個(ge)新管，直(zhi)接(jie)接(jie)步驟(zhou) 12。)

10. 42℃水(shui)浴(yu)，溶液(ye)又(you)會變為(wei)渾濁(zhuo)，顛倒(dao)混勻(yun)後 42℃溫育 5 分鐘。

11. 室溫 14,000 x g 離(li)心 5 min 分相，上(shang)層(ceng)水(shui)相含(han) DNA，下(xia)層(ceng)藍色(se)油狀相含(han)內(nei)毒(du)素和(he)其(qi)它(ta)雜(za)質。將(jiang)含(han)DNA 的上層(ceng)水(shui)相轉(zhuan)移到(dao)新管（註(zhu)意(yi)不要吸(xi)到(dao)藍色(se)油狀層(ceng)，裏(li)面(mian)含(han)內(nei)毒(du)素等(deng)雜(za)質），棄油(you)狀層(ceng)。

溶液(ye)必須分(fen)為(wei)上下(xia)兩(liang)相，否(fou)則(ze)應重復步驟(zhou) 10-11。

（溫度(du)低時，內(nei)毒(du)素清除(chu)劑無(wu)法(fa)分(fen)相，因此(ci)必須 20℃以上室(shi)溫(wen)離(li)心或者(zhe)保(bao)證冬(dong)季(ji)轉(zhuan)頭溫(wen)度(du) 20℃以(yi)上）

12.  將上壹(yi)步所(suo)得(de)上(shang)層(ceng)水(shui)相中(zhong)加入(ru)等(deng)體(ti)積(ji)雜(za)質清除(chu)液(ye)B（約(yue) 750 ul），輕柔混勻(yun)，4℃條件(jian)下(xia)14,000 x g 離(li)心 10 min，棄上(shang)清（註(zhu)意(yi)不要丟(diu)失 DNA），輕輕加(jia)入(ru) 1 ml 70%乙醇洗(xi)滌，離(li)心棄上(shang)清，再用 1 ml 70%乙醇洗(xi)滌壹(yi)次(ci)，室溫倒(dao)置(zhi)晾(liang)幹 5~10 min 使(shi)乙(yi)醇(chun)完quan揮(hui)發(fa)。

13.  每個離(li)心管加(jia) 50~100 ul 純水(shui)或者(zhe) TE 溶解沈澱(dian)（可在(zai) 37℃水(shui)浴(yu)中(zhong)振(zhen)蕩以(yi)輔(fu)助溶解）。要註(zhu)意(yi)很多質(zhi)粒 DNA 可能附著在(zai)離(li)心管側(ce)壁(bi)上，即(ji)使(shi)看(kan)不(bu)見，也應該(gai)充(chong)分(fen)吹(chui)打側壁(bi)溶解回(hui)收質粒 DNA。（質粒 DNA 可以根據需要，選(xuan)擇任意(yi)小體(ti)積(ji)的(de)純(chun)水(shui)溶解，濃度(du)可(ke)達 5-10ug/ul）

無內(nei)毒(du)素質(zhi)粒中(zhong)量提取試劑盒 核(he)酸提取