諾博(bo)萊德 無(wu)內毒(du)素(su)質(zhi)粒(li)大(da)提(ti)試(shi)劑(ji)盒 核(he)酸(suan)提(ti)取(qu)

EndoFree Plasmid Maxi Kit無內毒(du)素(su)質(zhi)粒(li)大(da)提(ti)試(shi)劑(ji)盒

目錄號(hao)：31112-10

產(chan)品內容(rong)：

保存(cun)條件(jian)：

在(zai)室溫(wen)(15~25℃)幹(gan)燥條件(jian)下，可(ke)保存(cun)12個(ge)月。

RNaseA可常溫(wen)運(yun)輸(shu)，-20℃保(bao)存(cun)。

具體(ti)產(chan)品的(de)參數以收(shou)到產(chan)品說(shuo)明書(shu)的(de)參數為(wei)準(zhun)

產(chan)品簡(jian)介：

無內素(su)質(zhi)粒(li)大(da)量(liang)提(ti)取(qu)試(shi)劑(ji)盒可(ke)快速從(cong) 100-300ml 菌液(ye)中(zhong)提(ti)取(qu)質(zhi)粒(li)，采用改(gai)進的(de) SDS-堿(jian)裂(lie)解(jie)法(fa)裂(lie)解(jie)細(xi)胞(bao)，然(ran)後離心吸附柱(zhu)內的(de)矽(gui)基質(zhi)膜(mo)在(zai)高(gao)鹽、低 pH 值狀態下選(xuan)擇性(xing)地(di)結(jie)合(he)溶液(ye)中的(de)質(zhi)粒(li) DNA，再通(tong)過(guo)去(qu)蛋(dan)白(bai)液和(he)漂洗(xi)液將(jiang)雜(za)質(zhi)和(he)其(qi)它(ta)細(xi)菌(jun)成(cheng)分(fen)去除，最(zui)後(hou)低鹽(yan)、高(gao) pH 值的(de)洗(xi)脫緩(huan)沖液將(jiang)純(chun)凈質(zhi)粒(li) DNA 從矽(gui)基質(zhi)膜(mo)上(shang)洗(xi)脫。所(suo)得(de)質(zhi)粒(li)可直接用於(yu)酶(mei)切、轉化、PCR、 RT-qPCR、測序及轉染(ran)等分子生(sheng)物學實驗。

產(chan)品特點：

1.   內毒(du)素(su)含(han)量(liang)低（< 10 EU/ug DNA），細胞(bao)轉染(ran)效果(guo)好(hao)。

2.   得率高(gao)：150–300 ml 菌液(ye)可(ke)提(ti)出(chu)多(duo)達(da) 500– 2000 ug 的(de)純(chun)凈質(zhi)粒(li)。

重要(yao)提(ti)示(shi)：

壹、使(shi)用前(qian)請先(xian)檢查(zha)平衡(heng)液(ye)、溶液(ye) P2 和溶液(ye) N3 是否(fou)出(chu)現(xian)渾(hun)濁，如有(you)混(hun)濁現(xian)象，可(ke)在(zai) 37℃

水浴中加(jia)熱(re)幾分鐘，即(ji)可恢(hui)復澄(cheng)清，不(bu)要(yao)劇烈搖(yao)晃(huang)，以免(mian)形成(cheng)過(guo)量(liang)的(de)泡沫(mo)。

二、第壹次使(shi)用前(qian)請先(xian)在(zai)去(qu)蛋(dan)白(bai)液 PE、漂洗(xi)液 WB 中加(jia)入指ding量(liang)無水(shui)乙(yi)醇（見瓶身標(biao)簽），充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)，並做好(hao)標(biao)記(ji)，以免(mian)多(duo)次(ci)加(jia)入。

三、首ci使(shi)用時(shi)請(qing)先(xian)將 RNase A 全部加(jia)到溶液(ye) P1 中，混(hun)勻(yun)，每(mei)次(ci)使(shi)用後(hou)置於 2 ~ 8℃保存(cun)。

操作(zuo)步(bu)驟：

1.取 150 ~ 200 ml（最多(duo) 300ml）過(guo)夜培(pei)養(yang)的(de)菌液(ye)，室溫(wen) 12,000 x g 離心(xin) 1 min，盡量(liang)倒幹(gan)上(shang)清，收(shou)集菌體(ti)。

（註(zhu)意： 如果(guo)用 50ml 離心(xin)管(guan)收(shou)集菌體(ti)，離心(xin)棄(qi)上(shang)清後，在(zai)同(tong)壹管(guan)內加(jia)入更多(duo)的(de)菌液(ye)，重復步(bu)驟 1，直到收(shou)集到足(zu)夠多(duo)的(de)菌體(ti)）

2. 加入 7.5 ml 溶液(ye) P1，重懸(xuan)菌(jun)體(ti)沈(chen)澱，渦旋震(zhen)蕩(dang)至徹di懸浮。

（註(zhu)意：如有(you)未(wei)徹di懸浮(fu)的(de)菌塊(kuai)會(hui)影響(xiang)裂(lie)解(jie)，導(dao)致(zhi)提(ti)取(qu)的(de)質(zhi)粒(li)濃(nong)度及純(chun)度降低）

3. 加入 7.5 ml 溶液(ye) P2，溫(wen)和(he)地(di)上(shang)下翻轉 6-8 次，使(shi)菌體(ti)充(chong)分(fen)裂(lie)解(jie)，室溫(wen)放置 4 min。

（註(zhu)意：不(bu)可(ke)劇烈震(zhen)蕩(dang)，以免(mian)造成(cheng)基因(yin)組 DNA 片段的(de)汙(wu)染，所(suo)用(yong)時(shi)間(jian)不(bu)要(yao)超(chao)過(guo) 5 min，以免(mian)質(zhi)粒(li)受(shou)到破(po)壞，如未(wei)完quan變(bian)得清(qing)亮，可能是(shi)菌(jun)體(ti)太多(duo)，可(ke)增(zeng)加(jia)溶液(ye) P2 的(de)用量(liang)，在(zai)後(hou)續的(de)操作(zuo)中(zhong)溶液(ye) P3 的(de)用量(liang)也要(yao)相應增(zeng)加(jia)）

4. 加入 7.5 ml 溶液(ye)N3，立即(ji)溫(wen)和(he)地(di)上(shang)下翻轉 6-8 次，充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)時(shi)會(hui)出現(xian)白(bai)色絮(xu)狀沈(chen)澱，然(ran)後室溫(wen) 12,000 x g 離心(xin) 10 ~ 15 min,小心(xin)取(qu)上(shang)清至新(xin)管(guan)。

（註(zhu)意：加入溶液(ye) P3 後應立(li)即(ji)混(hun)合(he)，避(bi)免(mian)產(chan)生(sheng) SDS 的(de)局部(bu)沈(chen)澱）

5. 向上(shang)清中加入 0.5 倍體(ti)積(ji)的(de)異(yi)丙(bing)醇（約 10 ml），充(chong)分(fen)顛(dian)倒混(hun)勻(yun)，分兩次（每(mei)次(ci)不(bu)超(chao)過(guo) 10 ml）轉入吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)（吸(xi)附柱(zhu)放入收(shou)集管(guan)中），12,000 x g 離心(xin) 1min，質(zhi)粒(li)被吸附(fu)在(zai)膜(mo)上(shang)，倒掉(diao)收(shou)集管(guan)中的(de)濾液(ye)，直到所(suo)有(you)混(hun)合(he)溶液(ye)通(tong)過(guo)此(ci)吸(xi)附(fu)柱(zhu)。

6.   可選(xuan)步(bu)驟：向吸附柱(zhu)中(zhong)加(jia)入 10 ml 去蛋(dan)白(bai)液 PE，室溫(wen) 12,000 x g 離心(xin) 1 min，棄濾(lv)液(ye)。

（註(zhu)意：去蛋(dan)白(bai)液 PE 為(wei)濃(nong)縮(suo)液(ye)，按要求加(jia)入無水(shui)乙(yi)醇，用後應立(li)即(ji)蓋(gai)緊(jin)瓶蓋(gai)，以防(fang)酒精(jing)揮(hui)發）

（註(zhu)意：如果(guo)宿主菌是(shi) endA-，如 DH5α，此(ci)步(bu)驟可省略(lve)。如果宿(xiu)主菌(jun)是(shi) endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此(ci)步(bu)驟不(bu)可(ke)省略，因(yin)這(zhe)些(xie)宿主(zhu)菌含(han)有大(da)量(liang)的(de)核(he)酸(suan)酶(mei)，易(yi)降解質(zhi)粒(li)。如果提(ti)取(qu)低拷貝(bei)質(zhi)粒(li)也推薦(jian)采(cai)用(yong)此(ci)步(bu)驟）

7.  加入 10 ml 漂洗(xi)液 WB，室溫(wen) 12,000 x g 離心(xin) 1 min，棄濾(lv)液(ye)。

（註(zhu)意：漂洗(xi)液 WB 為(wei)濃(nong)縮(suo)液(ye)，按要求加(jia)入無水(shui)乙(yi)醇，用後應立(li)即(ji)蓋(gai)緊(jin)瓶蓋(gai)，以防(fang)酒精(jing)揮(hui)發）

8.  重復步(bu)驟 10 壹次。

9.  將吸(xi)附(fu)柱(zhu)放進收(shou)集管(guan)，室溫(wen) 12,000 x g 離心(xin) 3 min，甩幹膜(mo)上(shang)殘留(liu)乙(yi)醇。開蓋室溫(wen)晾幹3 min，以免(mian)殘留(liu)乙(yi)醇影響(xiang)下遊(you)應用(yong)。

10. 將吸(xi)附(fu)柱(zhu)置於壹個(ge)新(xin)的(de) 50 ml 離心(xin)管(guan)（自備）中，加(jia)入 1 ~ 2 ml 的(de)洗(xi)脫緩(huan)沖液EB，室溫(wen)放置 2 min，12,000 rpm 離心(xin) 2 min，離心(xin)管(guan)底溶液(ye)即(ji)質(zhi)粒(li) DNA。

（註(zhu)意：事先(xian)在(zai) 65~70℃水(shui)浴中預(yu)熱(re)洗(xi)脫緩(huan)沖液 EB，可(ke)增加(jia)洗(xi)脫效率；如果(guo)需要較(jiao)多(duo)量(liang)質(zhi)粒(li)，可將得(de)到的(de)溶液(ye)重(zhong)新(xin)加入吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)，再次離心 1 min 收(shou)集；如需使(shi)用去(qu)離(li)子水洗(xi)脫，可(ke)用(yong) NaOH 調整其(qi) pH 值在(zai) 7.0 - 8.5 之間(jian)。）

無內毒(du)素(su)質(zhi)粒(li)大(da)提(ti)試(shi)劑(ji)盒 核(he)酸(suan)提(ti)取(qu)