諾博(bo)萊(lai)德(de) 無內(nei)毒素(su)質粒(li)大提(ti)試劑(ji)盒(he) 核酸提(ti)取

EndoFree Plus Plasmid Maxi Kit無內(nei)毒素(su)質粒(li)大提(ti)試劑(ji)盒(he)(增(zeng)強(qiang)型(xing))

目錄(lu)號：31113-10

產品(pin)內(nei)容：

保(bao)存條(tiao)件：

在室溫(15 ~ 25℃)幹燥(zao)條(tiao)件下，可保(bao)存 12 個月(yue)。

RNase  A、內(nei)毒素(su)清除(chu)劑(ji)，可(ke)常溫運(yun)輸，-20℃保(bao)存。

產品(pin)簡介(jie)：

無內(nei)毒素(su)質粒(li)大量(liang)提(ti)取試(shi)劑(ji)盒(he)可(ke)提(ti)取 100-300ml 菌液(ye)，采用(yong)改進的 SDS-堿裂解(jie)法裂解(jie)細胞(bao)，通(tong)過獨te的(de)內(nei)毒素(su)清除(chu)劑(ji)選(xuan)擇(ze)性結合離(li)心除(chu)去內(nei)毒素(su)，然後離(li)心吸附柱內(nei)的矽(gui)基(ji)質膜在高鹽、低pH值(zhi)狀(zhuang)態(tai)下選擇(ze)性地結合溶(rong)液(ye)中的質粒(li)DNA，再通(tong)過去蛋(dan)白液(ye)和漂(piao)洗液(ye)將(jiang)雜質和(he)其(qi)它(ta)細菌成(cheng)分去除(chu)，最後低鹽、高pH 值(zhi)的(de)洗(xi)脫(tuo)緩沖液(ye)將(jiang)純凈(jing)質粒(li) DNA 從(cong)矽基(ji)質膜上洗脫(tuo)。所(suo)得(de)質粒(li)可(ke)直接(jie)用(yong)於(yu)酶切(qie)、轉(zhuan)化(hua)、PCR、RT-qPCR、測(ce)序(xu)及轉(zhuan)染(ran)等分子(zi)生物學實(shi)驗(yan)。

具(ju)體(ti)產(chan)品(pin)的(de)參數以收到產(chan)品說明(ming)書(shu)的參數(shu)為(wei)準

產品(pin)特點：

1.        獨te工(gong)藝(yi)配方(fang)清除(chu)內(nei)毒素(su)，內(nei)毒素(su)含(han)量(liang)極(ji)低(di)（< 0.1 EU/ug DNA），細胞(bao)轉(zhuan)染(ran)效果(guo)極jia。

2.        得(de)率高： 150 – 300 ml 菌液(ye)可提(ti)出(chu)多達 500– 2000 ug 的純凈(jing)質粒(li)。

重(zhong)要提(ti)示：

壹、使(shi)用(yong)前請先(xian)檢查(zha)平衡(heng)液(ye)、溶液(ye) P2 和溶(rong)液(ye) N3 是否(fou)出(chu)現渾濁(zhuo)，如(ru)有(you)混(hun)濁(zhuo)現象，可(ke)在 37℃

水(shui)浴中(zhong)加(jia)熱幾分鐘(zhong)，即(ji)可恢(hui)復澄清，不要劇(ju)烈(lie)搖晃，以免形成(cheng)過(guo)量(liang)的(de)泡沫。

二(er)、第(di)壹次使用(yong)前請先(xian)在去蛋(dan)白液(ye) PE、漂(piao)洗液(ye) WB 中加(jia)入(ru)指ding量(liang)無(wu)水(shui)乙(yi)醇（見(jian)瓶身(shen)標(biao)簽），充(chong)分混(hun)勻(yun)，並做好標(biao)記(ji)，以免多(duo)次加入(ru)。

三(san)、首ci使用(yong)時請(qing)先(xian)將(jiang) RNase A 全部加到溶(rong)液(ye) P1 中，混(hun)勻(yun)，每(mei)次使用(yong)後置於(yu) 2 ~ 8℃保(bao)存。

操(cao)作步驟(zhou)：

1.   取 150 ~ 200 ml（最多 300ml）過夜(ye)培(pei)養(yang)的(de)菌液(ye)，室溫 9,000 rpm 離(li)心 1 min，盡量(liang)倒(dao)幹(gan)上清，收集菌體。

（註(zhu)意(yi)： 如果(guo)用(yong) 50ml 離(li)心管(guan)收集菌體，離(li)心棄上清後，在同(tong)壹管(guan)內(nei)加入(ru)更(geng)多的(de)菌液(ye)，重(zhong)復步驟(zhou) 1）

2. 加入(ru) 7.5 ml 溶液(ye) P1，重(zhong)懸菌體沈(chen)澱(dian)，渦旋(xuan)震(zhen)蕩(dang)至(zhi)徹(che)di懸(xuan)浮。

（註(zhu)意(yi)：如有(you)未徹(che)di懸(xuan)浮的菌塊會(hui)影(ying)響裂解(jie)，導致提(ti)取的(de)質粒(li)濃(nong)度(du)及純度(du)降低）

3.  加入(ru) 7.5 ml 溶液(ye) P2，溫和(he)地上(shang)下翻轉(zhuan) 6-8 次，使菌體充(chong)分裂解(jie)，室溫放(fang)置 4 min。

（註(zhu)意(yi)：不可劇(ju)烈(lie)震(zhen)蕩(dang)，以免造(zao)成(cheng)基(ji)因組 DNA 片段的汙染(ran)，所(suo)用(yong)時間(jian)不要超(chao)過(guo) 5 min，以免質粒(li)受(shou)到(dao)破(po)壞，如(ru)未完(wan)quan變(bian)得(de)清亮，可(ke)能是菌體太多，可增(zeng)加(jia)溶(rong)液(ye) P2 的用(yong)量(liang)，在後續(xu)的(de)操(cao)作中溶液(ye) P3 的用(yong)量(liang)也(ye)要(yao)相(xiang)應(ying)增加）

4.  加入(ru) 7.5 ml 溶液(ye)N3，立(li)即(ji)溫(wen)和(he)地上下翻轉(zhuan) 6-8 次，充(chong)分混(hun)勻(yun)時(shi)會(hui)出(chu)現白色絮(xu)狀(zhuang)沈(chen)澱(dian)，

然後室溫 9,000 rpm 離(li)心 10 min,小心取上清至(zhi)新管(guan)。

（註(zhu)意(yi)：加入(ru)溶(rong)液(ye) N3 後應(ying)立(li)即(ji)混(hun)合(he)，避免產(chan)生 SDS 的局部(bu)沈(chen)澱(dian)）

5.  加入(ru) 0.1 體積(ji)(上清的體(ti)積(ji)的 10%，約 2.4 ml)的內(nei)毒素(su)清除(chu)劑(ji)到(dao)上(shang)壹(yi)步所(suo)得(de)上(shang)清，顛倒

旋(xuan)轉(zhuan)混(hun)勻(yun)。冰浴(或(huo)冰箱(xiang)冷(leng)凍室)放(fang)置 5 分鐘(zhong)，直到渾(hun)濁(zhuo)變(bian)清亮透(tou)明(ming)（或(huo)仍舊稍(shao)有(you)渾濁(zhuo)），中間(jian)偶(ou)爾混(hun)勻(yun)幾(ji)次。

（註(zhu)意(yi)：內(nei)毒素(su)清除(chu)劑(ji)加(jia)入(ru)上(shang)清後，上(shang)清會(hui)變(bian)得(de)渾(hun)濁(zhuo)，但是冰浴後(hou)應(ying)恢復清亮,或(huo)稍(shao)渾(hun)濁。）

6. 常溫放(fang)置 3 ~ 5 分鐘(zhong)，溶(rong)液(ye)很快(kuai)變(bian)為(wei)渾濁(zhuo)，顛倒混(hun)勻(yun)。（37℃水(shui)浴可(ke)加(jia)速(su)渾濁(zhuo)）

7. 室溫 9,000 rpm 離(li)心 10 min 分相(xiang)。上(shang)層(ceng)水(shui)相(xiang)含(han) DNA，下層藍(lan)色(se)油狀(zhuang)相(xiang)含(han)內(nei)毒素(su)和(he)其(qi)它(ta)雜質。將(jiang)含(han) DNA 的(de)上(shang)層水(shui)相(xiang)（上(shang)清）轉(zhuan)移(yi)到新(xin)管(guan)，棄油狀(zhuang)層(ceng)。

8.加入(ru) 0.5 倍上(shang)清體積(ji)的異(yi)丙(bing)醇（約 11 ml）,充(chong)分顛倒混(hun)勻(yun)，分兩(liang)次（每次不超過(guo) 10 ml）轉(zhuan)入(ru)吸(xi)附柱中（吸附柱放(fang)入(ru)收集管(guan)中），9,000 rpm 離(li)心 1min，質粒(li)被吸(xi)附在膜上，倒(dao)棄(qi)收集管(guan)中的(de)濾(lv)液(ye)，直到所(suo)有(you)混(hun)合(he)溶液(ye)通(tong)過此吸附柱。

9.可選(xuan)步驟(zhou)：向吸附柱中加入(ru) 10 ml 去蛋(dan)白液(ye) PE，室溫 9,000 rpm 離(li)心 1 min，棄濾(lv)液(ye)。

（註(zhu)意(yi)：去蛋(dan)白液(ye) PE 為(wei)濃縮(suo)液(ye)，按(an)要(yao)求加入(ru)無(wu)水(shui)乙(yi)醇，用(yong)後應(ying)立(li)即(ji)蓋(gai)緊(jin)瓶蓋，以防(fang)酒精揮發）

（註(zhu)意(yi)：如果(guo)宿主(zhu)菌是 endA-，如 DH5α，此步驟(zhou)可(ke)省(sheng)略。如果(guo)宿主(zhu)菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此(ci)步驟(zhou)不可省(sheng)略，因這(zhe)些宿主(zhu)菌含(han)有(you)大量(liang)的(de)核酸酶，易(yi)降解(jie)質粒(li)。如(ru)果(guo)提(ti)取低(di)拷(kao)貝質粒(li)也(ye)推(tui)薦采(cai)用(yong)此步驟(zhou)）

10.    加入(ru) 10 ml 漂(piao)洗液(ye) WB，室溫 9,000 rpm 離(li)心 1 min，棄濾(lv)液(ye)。

（註(zhu)意(yi)：漂(piao)洗液(ye) WB 為(wei)濃縮(suo)液(ye)，按(an)要(yao)求加入(ru)無(wu)水(shui)乙(yi)醇，用(yong)後應(ying)立(li)即(ji)蓋(gai)緊(jin)瓶蓋，以防(fang)酒精揮發）

11.      重(zhong)復步驟(zhou) 10 壹次。

12.   將(jiang)吸附柱放(fang)進收集管(guan)，室溫 9,000 rpm 離(li)心 3 min，甩幹(gan)膜上殘(can)留(liu)乙(yi)醇。

13. 將(jiang)吸附柱置於(yu)壹(yi)個新的(de) 50 ml 離(li)心管(guan)（自備）中，加(jia)入(ru) 1 ~ 2 ml 的洗(xi)脫緩(huan)沖液(ye)EB，室溫放(fang)置 2 min，9,000 rpm 離(li)心 2 min，離(li)心管(guan)底溶(rong)液(ye)即質粒(li) DNA。

（註(zhu)意(yi)：事(shi)先(xian)在 65~70℃水(shui)浴中(zhong)預熱洗脫緩沖液(ye) EB，可增加(jia)洗(xi)脫(tuo)效率；

如果(guo)需(xu)要較(jiao)多(duo)量(liang)質粒(li)，可(ke)將(jiang)得(de)到(dao)的(de)溶液(ye)重(zhong)新加入(ru)吸(xi)附柱中，再次離(li)心 1 min 收集；如需(xu)使用(yong)去離(li)子(zi)水(shui)洗脫(tuo)，可(ke)用(yong) NaOH 調(tiao)整(zheng)其(qi) pH 值(zhi)在 7.0 - 8.5 之間(jian)。）

 無內(nei)毒素(su)質粒(li)大提(ti)試劑(ji)盒(he) 核酸提(ti)取