轉(zhuan)染(ran)級質(zhi)粒(li)大提試劑(ji)盒(he)(溶(rong)液(ye)型(xing)) 核酸提取

EndoFree Plasmid Maxi Kit轉(zhuan)染(ran)級質(zhi)粒(li)大量(liang)提試劑(ji)盒(he)（溶(rong)液(ye)型(xing)）

目(mu)錄(lu)號(hao)：31114-20

產(chan)品(pin)內容：

保(bao)存條件(jian)：

在室(shi)溫 (15 ~ 25℃) 條件(jian)下(xia)，可保存 12 個(ge)月。

RNase  A、內毒素清(qing)除(chu)劑，可常溫運輸，-20℃保存。

適(shi)用(yong)範圍：

特別(bie)適合用於大量轉(zhuan)染(ran)級質(zhi)粒(li)的(de)制備，以及 BAC/PAC 等大(da)型質粒(li)的(de)制備。

具體(ti)產(chan)品(pin)的(de)參數(shu)以收(shou)到產(chan)品(pin)說(shuo)明(ming)書(shu)的(de)參數(shu)為準

產(chan)品(pin)簡介：

采(cai)用(yong)獨(du)te的(de)溶(rong)液(ye)配(pei)方和內毒素清(qing)除(chu)試劑，只需(xu)要幾次簡單的(de)離(li)心，就可以去除(chu)蛋白(bai)質、多(duo)糖(tang)、內毒素、RNA 等(deng)雜(za)質，獲得(de)高質量(liang)的(de)轉(zhuan)染(ran)級質(zhi)粒(li) DNA，可直接(jie)應(ying)用於細(xi)胞(bao)轉(zhuan)染(ran)甚至動(dong)物(wu)體(ti)內實(shi)驗(yan)等對(dui) DNA 純度要求很(hen)高(gao)的(de)工(gong)作中(zhong)。

本方法(fa)提取純化質(zhi)粒(li) DNA，對(dui)質粒(li)損傷小(xiao)，即使是 10kb 甚至 100kb 以上的(de)大(da)型質粒(li)或超(chao)大(da)型 BAC/PAC 質(zhi)粒(li)，都可以有效純化。獲(huo)得(de)的(de)質(zhi)粒(li)產(chan)量(liang)高，濃度(du)可高達(da) 5ug /ul，超(chao)螺(luo)旋比例可高達(da) 95%，無內毒素，轉(zhuan)染(ran)效果(guo)極(ji)jia。

重(zhong)要提示：

壹(yi)、環(huan)境溫度低時(shi)溶(rong)液(ye) P2 中(zhong) SDS 可能(neng)會析(xi)出出現(xian)渾(hun)濁(zhuo)或(huo)者沈(chen)澱，可在 37℃水(shui)浴加(jia)熱幾(ji)分(fen)鐘(zhong)，即可恢(hui)復澄(cheng)清(qing)，不(bu)要劇烈搖(yao)晃，以免形(xing)成過(guo)量(liang)的(de)泡沫。

二(er)、提取大(da)質(zhi)粒(li)時, 操(cao)作(zuo)動(dong)作(zuo)要輕柔(rou)，剪(jian)掉壹(yi)部分(fen)吸(xi)頭(tou)的(de)尖嘴，以增(zeng)大開口，防止(zhi)機(ji)械剪(jian)切對(dui) DNA 的(de)損壞。

三(san)、提取的(de)質(zhi)粒(li)量與(yu)細(xi)菌(jun)培養濃度(du)、質(zhi)粒(li)拷貝數(shu)等因(yin)素有(you)關(guan)。如(ru)果(guo)所提質粒(li)為低拷貝質粒(li)或大(da)於 10kb 的(de)大(da)質粒(li)，應加(jia)大菌(jun)體(ti)使用量(liang)，同時按(an)比例增(zeng)加(jia) P1、P2、P3 的(de)用(yong)量。

四(si)、得(de)到的(de)質(zhi)粒(li) DNA 電(dian)泳(yong)時(shi)可能(neng)為單壹(yi)條帶(dai)，也(ye)可能(neng)為 2 條或(huo)者多條 DNA 條帶(dai)，這(zhe)主要是(shi)不(bu)同程度(du)的(de)超(chao)螺(luo)旋構(gou)象(xiang)質(zhi)粒(li)泳(yong)動(dong)位(wei)置(zhi)不(bu)壹(yi)造(zao)成(cheng)，與(yu)提取物(wu)培(pei)養(yang)時間(jian)長(chang)短、提取時(shi)操(cao)作(zuo)劇烈程(cheng)度(du)等(deng)有關。本公司產(chan)品(pin)正常操作(zuo)情況(kuang)下(xia)基本超(chao)螺(luo)旋可以超(chao)過(guo) 95%。

五(wu)、首ci使用時(shi)請先(xian)將(jiang) RNase A 全部加(jia)到溶(rong)液(ye) P1 中(zhong)，混勻(yun)，每次使用後(hou)置(zhi)於(yu) 2 ~ 8℃保(bao)存。

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1.   取(qu) 150 ml（最(zui)多(duo) 200ml）過(guo)夜(ye)培(pei)養的(de)菌(jun)液(ye)，12,000 x g 於(yu) 4℃離(li)心 2 min，盡量(liang)倒(dao)幹上清(qing)，收(shou)集菌(jun)體(ti)。

（註(zhu)意(yi)： 如(ru)果(guo)用 50 ml 離(li)心管收(shou)集菌(jun)體(ti)，離(li)心棄上清(qing)後(hou)，在同壹(yi)管內加(jia)入更(geng)多(duo)的(de)菌(jun)液(ye)，重(zhong)復步(bu)驟(zhou) 1，直到收(shou)集到足(zu)夠(gou)多的(de)菌(jun)體(ti)）

2.  加(jia)入 5 ml 溶(rong)液(ye)P1，重(zhong)懸菌體(ti)沈(chen)澱，渦旋(xuan)震蕩至(zhi)徹(che)di懸(xuan)浮(fu), 室(shi)溫放置(zhi)3~5分(fen)鐘(zhong)。

（註(zhu)意(yi)：如(ru)有(you)未(wei)徹di懸(xuan)浮(fu)的(de)菌(jun)塊(kuai)會影(ying)響裂解(jie)，導(dao)致提取的(de)質(zhi)粒(li)濃度(du)及(ji)純度降低）

3. 加(jia)入 5 ml 溶(rong)液(ye)P2，溫和地(di)上下(xia)翻(fan)轉(zhuan) 6-8 次，使菌體(ti)充(chong)分(fen)裂(lie)解(jie)，室(shi)溫放置(zhi) 4 min。

（註(zhu)意(yi)：不(bu)可劇烈震蕩，以免造(zao)成(cheng)基因(yin)組 DNA 片段(duan)的(de)汙染(ran)，所用(yong)時(shi)間(jian)不(bu)要超(chao)過(guo) 5 min，以免質粒(li)受(shou)到破(po)壞(huai)，如未(wei)完quan變(bian)得(de)清亮(liang)，可能(neng)是菌(jun)體(ti)太(tai)多，可增(zeng)加(jia)溶液(ye) P2 的(de)用(yong)量，在後(hou)續的(de)操(cao)作中(zhong)溶液(ye) P3 的(de)用(yong)量(liang)也(ye)要相(xiang)應(ying)增(zeng)加(jia)）

4. 加(jia)入 5 ml 溶(rong)液(ye)P3，立(li)即溫和地(di)上下(xia)翻(fan)轉(zhuan) 6-8 次，充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)，至白(bai)色絮狀(zhuang)物產(chan)生(sheng)，然(ran)後(hou)

12,000 x g 於(yu) 4℃離(li)心 10 ~ 15 min, 小(xiao)心取上清(qing)，移(yi)入新(xin)的(de) 50 ml 離(li)心管中(zhong)。

（註(zhu)意(yi)：加(jia)入溶(rong)液(ye) P3 後(hou)應(ying)立(li)即混(hun)合，避免產(chan)生(sheng) SDS 的(de)局(ju)部(bu)沈(chen)澱）

5.加(jia)入 10 ml 異(yi)丙醇，上下(xia)顛倒(dao)離心管，充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)。

6.   在 4℃條件(jian)下(xia) 12,000~16,000 x g 離(li)心 10 min，小(xiao)心棄去上清(qing)，倒(dao)置輕(qing)輕(qing)瀝幹(gan)殘(can)余(yu)液(ye)體(ti)，加(jia)入 3-5ml 70%乙(yi)醇漂(piao)洗壹(yi)遍，最(zui)高(gao)速離(li)心 5 分鐘，棄上清(qing)，晾(liang)幹沈(chen)澱。

（註(zhu)意(yi)：DNA 沈(chen)澱如果(guo)幹燥過(guo)頭(tou)，DNA 將(jiang)無(wu)法(fa)完quan溶(rong)解(jie)，但是(shi)如果(guo)乙(yi)醇沒(mei)有晾幹揮(hui)發(fa)幹(gan)凈(jing)，殘(can)留太(tai)多，也(ye)會造(zao)成(cheng) DNA 無(wu)法(fa)完quan溶(rong)解(jie)。）

7.  加(jia)入 1.4 ml 溶(rong)液(ye)P1 完quan溶(rong)解(jie)沈(chen)澱團(tuan)塊(kuai)，註意(yi)附(fu)著(zhe)在側(ce)壁上的(de)質(zhi)粒(li)沈(chen)澱雖然(ran)看(kan)不(bu)見(jian)，也(ye)

要吹打(da)側(ce)壁涮洗下(xia)來（大(da)質粒(li)可用寬(kuan)口吸管輕(qing)輕(qing)吹打輔助(zhu)溶解(jie)）。然(ran)後(hou)將(jiang)質(zhi)粒(li)溶液(ye)轉(zhuan)入(ru)

2 個(ge)新(xin)的(de) 1.5 ml 離(li)心管中(zhong)（每(mei)個(ge) 700 ul）。

8.        可選步(bu)驟(zhou)（壹(yi)般不(bu)需(xu)要）：如(ru)果(guo)菌(jun)株 RNA 豐(feng)富(fu)有微(wei)量 RNA 殘(can)留，可在此(ci)步(bu)驟(zhou)後(hou)將(jiang)質(zhi)粒(li)溶液(ye) 60℃孵(fu)育(yu) 15 min 消(xiao)化 RNA。

9.每(mei)管加(jia)入 55 ul 雜(za)質清除(chu)液(ye) A，顛倒(dao)充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)後(hou), 加(jia)入約(yue) 0.1 體(ti)積 (約(yue) 80ul ) 冰(bing)預(yu)冷(leng)的(de)內毒素清(qing)除(chu)劑，顛倒(dao)旋轉(zhuan) 7-10 次（30 秒(miao)左(zuo)右(you)）充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)，上清(qing)會(hui)變(bian)得(de)渾濁(zhuo)，冰(bing)浴或者(zhe)冰(bing)上放(fang)置(zhi)>=5 min，中(zhong)間(jian)偶爾(er)顛倒(dao)混勻(yun)幾次，上清(qing)恢(hui)復清(qing)亮(liang)。

(註(zhu)意(yi)：如(ru)果(guo)不(bu)需(xu)要去內毒素用(yong)於(yu)轉(zhuan)染(ran)，可在此(ci)步(bu)驟(zhou)只(zhi)加(jia)入 55 ul 雜(za)質清除(chu)液(ye)A，充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)後(hou)冰(bing)上放(fang)置(zhi) 5 分(fen)鐘(zhong)，離(li)心後(hou)小(xiao)心取上清(qing)轉(zhuan)入(ru)壹(yi)個(ge)新(xin)管，直接(jie)接(jie)步(bu)驟(zhou) 12。)

10.     42℃水(shui)浴，溶液(ye)又(you)會變(bian)為渾濁(zhuo)，顛倒(dao)混勻(yun)後(hou) 42℃溫育 5 分(fen)鐘(zhong)。

11.     室(shi)溫 14,000 x g 離(li)心 5 min 分(fen)相(xiang)，上層水(shui)相(xiang)含(han) DNA，下(xia)層藍(lan)色(se)油狀相(xiang)含(han)內毒素和(he)其(qi)它雜(za)質。將含(han)DNA 的(de)上層水(shui)相(xiang)轉(zhuan)移(yi)到新(xin)管（註(zhu)意(yi)不(bu)要吸到藍(lan)色(se)油狀(zhuang)層，裏(li)面(mian)含內毒素等(deng)雜(za)質），棄(qi)油(you)狀(zhuang)層。

溶(rong)液(ye)必(bi)須分為上下(xia)兩相(xiang)，否則(ze)應重(zhong)復步(bu)驟(zhou) 10-11。

（溫度低時(shi)，內毒素清(qing)除(chu)劑無法(fa)分相(xiang)，因(yin)此必(bi)須 20℃以上室(shi)溫離心或者保證(zheng)冬(dong)季(ji)轉(zhuan)頭(tou)溫度 20℃以上）

12.     將(jiang)上壹(yi)步(bu)所得(de)上層水(shui)相(xiang)中(zhong)加(jia)入等(deng)體(ti)積雜(za)質清除(chu)液(ye)B（約(yue) 750 ul），輕(qing)柔(rou)混(hun)勻(yun)，14,000 x g於(yu) 4℃離(li)心 10 min，棄(qi)上清(qing)（註(zhu)意不(bu)要丟(diu)失 DNA），輕(qing)輕(qing)加(jia)入 1 ml 70%乙(yi)醇洗(xi)滌(di)，離心棄(qi)上清(qing)，再(zai)用(yong) 1 ml 70%乙(yi)醇洗(xi)滌(di)壹(yi)次，室(shi)溫倒(dao)置晾(liang)幹(gan) 5~10 min 使乙(yi)醇完quan揮(hui)發(fa)。

13.     每(mei)個(ge)離心管加(jia) 100~200 ul 純水(shui)或者(zhe) TE 溶(rong)解(jie)沈(chen)澱（可在 37℃水(shui)浴中(zhong)振(zhen)蕩以輔助溶(rong)解(jie)）。要註意(yi)很(hen)多(duo)質(zhi)粒(li) DNA 可能(neng)附(fu)著(zhe)在離(li)心管側(ce)壁上，即使看不(bu)見(jian)，也(ye)應該充(chong)分(fen)吹(chui)打側壁溶解(jie)回收(shou)質粒(li) DNA。（質(zhi)粒(li) DNA 可以根據需(xu)要，選擇(ze)任意(yi)小(xiao)體(ti)積的(de)純水(shui)溶解(jie)，濃度(du)可達(da) 5-10ug/ul）

 轉(zhuan)染(ran)級質(zhi)粒(li)大提試劑(ji)盒(he)(溶(rong)液(ye)型(xing)) 核酸提取