常規的離(li)心(xin)柱型質(zhi)粒抽(chou)提試劑(ji)盒並不(bu)適用(yong)於(yu)BAC/PAC/P1/Cosmid等大型質(zhi)粒DNA的抽(chou)提。這主(zhu)要(yao)是(shi)因(yin)為(wei)大型質(zhi)粒DNA分子量很大，常常會(hui)超過(guo)100kb而且壹般(ban)拷貝數低產(chan)量(liang)低(di)，使用(yong)常規的離(li)心(xin)柱吸(xi)附(fu)膜(mo)吸(xi)附(fu)效(xiao)率(lv)和(he)產(chan)量(liang)很(hen)低而且過(guo)膜(mo)會(hui)打斷(duan)這些(xie)大分(fen)子量的質粒(li)DNA。
轉(zhuan)染(ran)級(ji)BAC/PAC大型質(zhi)粒提取(qu)試劑(ji)盒

諾博萊(lai)德(de) 轉(zhuan)染(ran)級(ji)BAC/PAC大型質(zhi)粒提取(qu)試劑(ji)盒

轉(zhuan)染(ran)級(ji)BAC PAC大型質(zhi)粒提取(qu)試劑(ji)盒（溶液型）

目錄號：31210

        適用(yong)範圍(wei)：

適用(yong)於(yu)BAC/PAC/P1/Cosmid等大型質(zhi)粒制備

試劑(ji)盒組成(cheng)、儲(chu)存(cun)、穩定性：

本試劑(ji)盒在(zai)室溫儲(chu)存(cun)12個月不(bu)影(ying)響使(shi)用(yong)效(xiao)果(guo)。

儲(chu)存(cun)事項:

1.        第(di)壹次使用(yong)時，將(jiang)試(shi)劑(ji)盒所帶全部的RNase A加(jia)入溶液P1後（終濃(nong)度100μg /ml）置(zhi)於(yu)4℃保存(cun)。如果(guo)溶液P1中RNase A失(shi)活，提取(qu)的質粒(li)可(ke)能(neng)會(hui)混雜(za)有微量(liang)RNA殘留，在(zai)溶液P1中補(bu)加RNase A即可(ke)。

2.        內毒素清(qing)除劑(ji)在(zai)4℃可(ke)保(bao)存(cun)壹個月，如果(guo)要(yao)長(chang)期(qi)保存，建議保(bao)存(cun)在(zai)－20℃!

3.        環境溫度低(di)時(shi)溶液P2中SDS可(ke)能(neng)會(hui)析出(chu)出現渾濁或者沈(chen)澱，可(ke)在(zai)37℃水浴加熱幾分鐘，即(ji)可(ke)恢(hui)復(fu)澄(cheng)清(qing)，不要(yao)劇烈搖(yao)晃，以(yi)免(mian)形(xing)成(cheng)過(guo)量(liang)的(de)泡(pao)沫。

4.        避免(mian)試劑(ji)長(chang)時(shi)間暴露(lu)於(yu)空氣(qi)中產(chan)生(sheng)揮發、氧(yang)化、pH值變(bian)化，各(ge)溶液使(shi)用(yong)後應及(ji)時(shi)蓋(gai)緊蓋(gai)子。

具體產(chan)品(pin)的(de)參數以收(shou)到產(chan)品(pin)說(shuo)明(ming)書(shu)的(de)參(can)數為(wei)準

產(chan)品(pin)介紹(shao)：

常規的離(li)心(xin)柱型質(zhi)粒抽(chou)提試劑(ji)盒並不(bu)適用(yong)於(yu)BAC/PAC/P1/Cosmid等大型質(zhi)粒DNA的抽(chou)提。這主(zhu)要(yao)是(shi)因(yin)為(wei)大型質(zhi)粒DNA分子量很大，常常會(hui)超過(guo)100kb而且壹般(ban)拷貝數低產(chan)量(liang)低(di)，使用(yong)常規的離(li)心(xin)柱吸(xi)附(fu)膜(mo)吸(xi)附(fu)效(xiao)率(lv)和(he)產(chan)量(liang)很(hen)低而且過(guo)膜(mo)會(hui)打斷(duan)這些(xie)大分(fen)子量的質粒(li)DNA。本試(shi)劑(ji)盒采(cai)用(yong)改進(jin)堿(jian)裂解法從(cong)培(pei)養(yang)菌中提取(qu)質粒DNA，采(cai)用(yong)獨te的溶液配(pei)方和內毒素清(qing)除試(shi)劑(ji)，只需要幾次簡單(dan)離心(xin)去(qu)除(chu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)、多糖(tang)、內毒素、RNA等雜(za)質，獲(huo)得(de)高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)質粒DNA。純化DNA的OD260/280通常在(zai)1.8左(zuo)右(you)，得(de)到(dao)的(de)質(zhi)粒(li)可(ke)直(zhi)接(jie)應用(yong)於(yu)細(xi)胞轉(zhuan)染(ran)甚至(zhi)動物(wu)體內實(shi)驗等對DNA純度要(yao)求很高(gao)的(de)工作中。純化後期過(guo)程(cheng)均(jun)在(zai)1.5ml離(li)心(xin)管(guan)中操(cao)作，方(fang)法簡(jian)單(dan)，不(bu)需特殊(shu)設(she)備，無(wu)需過柱，不(bu)用(yong)酚氯(lv)仿抽(chou)提；基(ji)本可(ke)完(wan)quan回(hui)收(shou)細(xi)菌(jun)裂解釋放出的質(zhi)粒，不必(bi)擔心(xin)質(zhi)粒(li)DNA的(de)丟(diu)失(shi)。本方法提取(qu)純化質粒(li)DNA，對質粒損(sun)傷小(xiao)，即(ji)使是(shi)10kb甚至(zhi)100kb以(yi)上(shang)的(de)大型質(zhi)粒或超(chao)大型BAC/PAC質(zhi)粒，只要(yao)堿裂解法能(neng)夠(gou)提取(qu)，就(jiu)可(ke)以(yi)有效(xiao)純化。此(ci)外(wai)溶液型的(de)試劑(ji)可(ke)以(yi)按照(zhao)比(bi)例(li)放大縮(suo)小進(jin)行(xing)小提/中提/大提，最後可(ke)選擇任(ren)意小(xiao)體積(ji)溶解(jie)質(zhi)粒，濃度可(ke)高(gao)達(da)3μg/μl。

產(chan)品(pin)特(te)點：

1.        不需要使(shi)用(yong)有毒的ben酚，氯(lv)仿等試(shi)劑(ji)，也(ye)不需要乙醇沈(chen)澱。快(kuai)速(su)、 方便(bian)、從150 ml大腸桿(gan)菌LB((Luria-Bertani)培(pei)養(yang)液中，可(ke)快(kuai)速(su)提取(qu)典(dian)型產(chan)量(liang)30-50μg高(gao)純度BAC質(zhi)粒(li)DNA，提取(qu)率達80-90 %。

2.        獲(huo)得(de)的(de)質(zhi)粒(li)產(chan)量(liang)高(gao)，超螺(luo)旋(xuan)比(bi)例(li)高(gao)，純度好(hao)，可(ke)直(zhi)接(jie)用(yong)於(yu)轉(zhuan)染(ran)、測(ce)序(xu)、文(wen)庫(ku)等各(ge)種分子生(sheng)物(wu)學實(shi)驗。

3.        內毒素含量極低(di)（<10 EU/μg DNA），可(ke)直(zhi)接(jie)應用(yong)於(yu)細(xi)胞轉(zhuan)染(ran)。

註意(yi)事(shi)項：

1.        提取(qu)的質粒(li)量(liang)與(yu)細(xi)菌(jun)培(pei)養(yang)濃度、質(zhi)粒(li)拷貝數等因(yin)素有關(guan)。如果(guo)所(suo)提質粒(li)為(wei)低拷貝質(zhi)粒或(huo)大於(yu)10kb 的大質(zhi)粒(li)，應加(jia)大菌(jun)體(ti)使用(yong)量，同(tong)時(shi)按比(bi)例(li)增(zeng)加(jia)P1、P2、PⅢ的(de)用(yong)量。

2.        提取(qu)大質(zhi)粒(li)時操(cao)作動作要(yao)輕(qing)柔(rou)，應(ying)該(gai)使(shi)用(yong)剪大了(le)開口的(de)吸(xi)頭，防(fang)止機(ji)械(xie)剪切(qie)對DNA的損壞。

3.        DNA沈(chen)澱液沈(chen)澱離(li)心(xin)後，可(ke)能(neng)看(kan)不到(dao)明(ming)顯(xian)沈(chen)澱。如未見(jian)沈(chen)澱，擔心(xin)DNA丟(diu)失(shi)，可(ke)保(bao)留上(shang)清(qing)液，待(dai)完成(cheng)全(quan)部操(cao)作後電泳鑒定，以確(que)定是(shi)否獲(huo)得(de)終產(chan)物(wu)（數百微克DNA離心(xin)沈(chen)澱在(zai)管(guan)的側(ce)壁上(shang)，可(ke)能(neng)無(wu)法看(kan)到(dao)明(ming)顯(xian)團塊(kuai)）。

4.        得(de)到(dao)的(de)質(zhi)粒(li)DNA可(ke)用(yong)瓊脂糖(tang)凝(ning)膠電泳和紫外(wai)分光(guang)光(guang)度計檢測濃(nong)度與(yu)純度。OD260值為(wei)1相當於(yu)大約(yue)50μg/ml DNA。電(dian)泳可(ke)能(neng)為(wei)單壹條(tiao)帶，也(ye)可(ke)能(neng)為(wei)2條(tiao)或者多條(tiao)DNA條(tiao)帶，這主(zhu)要(yao)是(shi)不(bu)同(tong)程(cheng)度的(de)超(chao)螺(luo)旋(xuan)構象(xiang)質(zhi)粒泳動位(wei)置(zhi)不壹造(zao)成(cheng)，與(yu)提取(qu)物(wu)培(pei)養(yang)時間長(chang)短(duan)、提取(qu)時操(cao)作劇(ju)烈程(cheng)度等有關(guan)。本(ben)公司產(chan)品(pin)正(zheng)常操(cao)作情(qing)況下基(ji)本超(chao)螺(luo)旋(xuan)可(ke)以(yi)超(chao)過95%。

  操(cao)作步(bu)驟(zhou)：（實(shi)驗前請(qing)先(xian)閱讀(du)註意(yi)事(shi)項）

提示(shi)：將RNase A全部加入(ru)溶液P1中，混勻，使(shi)用(yong)後置於(yu)2-8℃保存(cun)。

1.    取(qu)過夜培(pei)養(yang)菌150 ml左(zuo)右(you)菌液（最(zui)大不(bu)超(chao)過180ml-200ml），裝(zhuang)入合適的(de)離(li)心(xin)瓶(ping)中，10,000 x g於(yu)4℃離心(xin)2 min沈(chen)澱菌(jun)體(ti)，完quan棄除(chu)上(shang)清(qing)。

2.   加入5 ml 溶液P1，充(chong)分混懸(xuan)震(zhen)蕩(dang)菌體沈(chen)澱，使(shi)其完quan分散(san)開(kai)，至(zhi)無(wu)絮塊存在(zai)。細(xi)菌(jun)懸(xuan)液移(yi)入50 ml離(li)心(xin)管(guan)中，室溫放置3~5 min。 

如果(guo)有未徹(che)di混勻的(de)菌(jun)塊(kuai)，會(hui)影響(xiang)裂解，導致提取(qu)量和純度偏低。

3.加入5 ml 溶液P2，輕(qing)輕顛(dian)倒離(li)心(xin)管(guan)6~8次，室溫放置4-5 min，使細(xi)菌(jun)完(wan)quan裂解，溶液透(tou)明。

溫和(he)地(di)混合，不要劇烈震蕩(dang)，以(yi)免(mian)基(ji)因(yin)組DNA剪切(qie)斷裂！所用(yong)時不(bu)應(ying)超過5分(fen)鐘！以免(mian)質粒(li)受(shou)到破壞。此(ci)時菌(jun)液應(ying)變得(de)清(qing)亮粘(zhan)稠，如果(guo)菌(jun)體(ti)少，很(hen)快(kuai)清(qing)亮粘(zhan)稠後就(jiu)可(ke)以(yi)做下壹步(bu)，不(bu)是(shi)壹定要準(zhun)確(que)的5分鐘(zhong)。如果(guo)未變(bian)得(de)清(qing)亮，可(ke)能(neng)由(you)於(yu)菌體(ti)過(guo)多，裂解不徹(che)di，應(ying)減(jian)少菌(jun)體(ti)量。

4.  加5 ml溶液PⅢ，立(li)即顛(dian)倒離(li)心(xin)管(guan)6~8次，充(chong)分混勻，至(zhi)白(bai)色(se)絮狀(zhuang)物(wu)產(chan)生(sheng)。上述(shu)裂解液於(yu)4℃ 12,000~16,000 x g離心(xin)10~15 min，小(xiao)心(xin)吸(xi)出上(shang)清(qing)，移入(ru)新的50 ml離心(xin)管(guan)中。

加入溶液PⅢ後應該(gai)立(li)即混勻，以(yi)免(mian)產(chan)生(sheng)SDS的局(ju)部沈(chen)澱。

5.  加入10 ml 異(yi)丙(bing)醇，顛倒離心(xin)管(guan)，充(chong)分混勻。

6.   於(yu)4℃ 12,000~16,000 x g離心(xin)10 min，小(xiao)心(xin)棄去(qu)上(shang)清(qing)，倒置(zhi)輕輕瀝幹(gan)殘(can)余液體(ti)，加入(ru)3-5ml 70%乙醇漂洗壹遍，最高(gao)速離心(xin)5分(fen)鐘(zhong)，棄上(shang)清(qing)，晾幹(gan)沈(chen)澱。

DNA沈(chen)澱如果(guo)幹(gan)燥(zao)過(guo)頭，DNA將(jiang)無(wu)法完(wan)quan溶解(jie)，但(dan)是(shi)如果(guo)乙醇沒有晾(liang)幹揮發幹(gan)凈，殘留太(tai)多，也(ye)會(hui)造(zao)成(cheng)DNA無(wu)法完(wan)quan溶解(jie)。

7.  加入1.4 ml 溶液P1完(wan)quan溶解(jie)沈(chen)澱團塊(kuai)，註意(yi)附(fu)著(zhe)在(zai)側(ce)壁上(shang)的質粒(li)沈(chen)澱雖(sui)然看不(bu)見，也(ye)要吹(chui)打側(ce)壁涮(shuan)洗下來（大質(zhi)粒(li)可(ke)用(yong)寬口吸(xi)管(guan)輕輕(qing)吹(chui)打輔(fu)助(zhu)溶解(jie)）。然後將質(zhi)粒(li)溶液轉(zhuan)入(ru)2個(ge)新(xin)的(de)1.5 ml離心(xin)管(guan)中（每個700μl）。

可(ke)選步(bu)驟(zhou)（壹般(ban)不需要）：如果(guo)菌(jun)株(zhu)RNA豐(feng)富(fu)有微量(liang)RNA殘留，可(ke)在(zai)此(ci)步(bu)驟(zhou)後將質(zhi)粒(li)溶液 60℃孵育15 min消化RNA。

8. 每管(guan)加入(ru)55μl雜(za)質清(qing)除液A，顛(dian)倒充(chong)分混勻後加入(ru)約(yue)0.1體積(ji)(約(yue)80μl)冰(bing)預(yu)冷(leng)的內毒素清(qing)除劑(ji)，顛(dian)倒(dao)旋(xuan)轉(zhuan)7-10次(ci)（30秒左(zuo)右(you)）充(chong)分混勻，冰(bing)浴(yu)或(huo)者冰上(shang)放置>=5分鐘(zhong)，中間偶爾顛(dian)倒(dao)混勻幾次。

內毒素清(qing)除劑(ji)加(jia)入(ru)上(shang)清(qing)後，上清(qing)會(hui)變得(de)渾(hun)濁(zhuo)，但(dan)是(shi)冰(bing)浴(yu)後應恢(hui)復(fu)清(qing)亮。

註意(yi)：如果(guo)不(bu)需要去(qu)內毒素用(yong)於(yu)轉(zhuan)染(ran)，可(ke)在(zai)此(ci)步(bu)驟(zhou)只加(jia)入55μl雜(za)質清(qing)除液A，充(chong)分混勻後冰上(shang)放置5分鐘(zhong)，離心(xin)後小心(xin)取(qu)上清(qing)轉(zhuan)入(ru)壹個新管(guan)，直(zhi)接(jie)接步(bu)驟(zhou)11。

9.  42℃水浴，溶液又(you)會(hui)變為(wei)渾濁(zhuo)，顛倒(dao)混勻後42℃溫育(yu)5分(fen)鐘。

10.室溫14,000 x g離(li)心(xin)5 min分(fen)相(xiang)（溫度低(di)時(shi)，內毒素清(qing)除劑(ji)無(wu)法分(fen)相(xiang)，因(yin)此(ci)必(bi)須至(zhi)少20℃以(yi)上(shang)室溫離(li)心(xin)或(huo)者保證(zheng)冬(dong)季轉(zhuan)頭溫度20℃以(yi)上(shang)）。上層水相含DNA，下層藍色(se)油(you)狀(zhuang)相含內毒素和其它(ta)雜(za)質。將含DNA的上層水相轉(zhuan)移(yi)到(dao)新(xin)管(guan)（註意(yi)不(bu)要(yao)吸(xi)到藍(lan)色(se)油(you)狀(zhuang)層，裏面(mian)含內毒素等雜(za)質），棄油(you)狀(zhuang)層。

溶液必(bi)須分(fen)為(wei)上下兩相(xiang)，否則(ze)應重(zhong)復步(bu)驟(zhou)9-10。

11.  將上壹步(bu)所(suo)得(de)上(shang)層水相中加(jia)入等體(ti)積(ji)雜(za)質清(qing)除液B（約(yue)750μl），輕柔(rou)混勻，4℃ 14,000 x g離(li)心(xin)10 min，棄上(shang)清(qing)（註意(yi)不(bu)要(yao)丟(diu)失(shi)DNA），輕輕加(jia)入(ru)1 ml 70%乙醇洗滌，離心(xin)棄上(shang)清(qing)，共兩次(ci)，室溫倒(dao)置(zhi)晾幹(gan)5~10 min使(shi)乙醇完quan揮發。

12.  每個離心(xin)管(guan)加適量(liang)TE或(huo)者純水（50~100μl）溶解(jie)沈(chen)澱（可(ke)在(zai)37℃水浴中振(zhen)蕩以輔(fu)助(zhu)溶解(jie)）。要(yao)註意(yi)很(hen)多質(zhi)粒(li)DNA可(ke)能(neng)附(fu)著(zhe)在(zai)離(li)心(xin)管(guan)側壁上(shang)，即使看(kan)不(bu)見，也(ye)應該(gai)充(chong)分吹(chui)打側(ce)壁溶解(jie)回(hui)收(shou)質粒(li)DNA。

最後沈(chen)澱可(ke)以(yi)根據需要選擇任(ren)意小(xiao)體積(ji)溶解(jie)，這樣(yang)可(ke)以(yi)得(de)到(dao)很(hen)高(gao)濃(nong)度的(de)轉(zhuan)染(ran)級(ji)質(zhi)粒(li)DNA（高達3-5μg/μl）。如果(guo)有需要，客(ke)戶(hu)也(ye)可(ke)以(yi)選擇更大體(ti)積(ji)溶解(jie)。 

轉(zhuan)染(ran)級(ji)BAC/PAC大型質(zhi)粒提取(qu)試劑(ji)盒