諾(nuo)博萊德(de) 酵(jiao)母(mu)高(gao)純度質(zhi)粒大提(ti)試(shi)劑(ji)盒 核(he)酸提取

HiPure Yeast Plasmid Mini Kit酵(jiao)母(mu)高(gao)純度質(zhi)粒大量(liang)快速(su)提試(shi)劑(ji)盒

目錄(lu)號：31119-10

產品內(nei)容：

保存條(tiao)件(jian)：

在(zai)室(shi)溫(15 ~ 25℃)幹燥(zao)條(tiao)件(jian)下，可保存 12 個(ge)月。加入(ru) RNase A 後的溶(rong)液 P1 應(ying)置於 2 ~ 8℃

保存，可穩(wen)定保存 6 個(ge)月,如(ru)果 P1 中(zhong) RNase A 失(shi)活(huo)，重(zhong)新補(bu)加(jia)即(ji)可。

具(ju)體產品的(de)參(can)數(shu)以(yi)收到(dao)產品說(shuo)明書(shu)的(de)參(can)數(shu)為準

產品簡(jian)介：

本(ben)試(shi)劑(ji)盒用(yong)於高(gao)純度酵(jiao)母(mu)質(zhi)粒 DNA 的(de)小量(liang)制(zhi)備。菌體經(jing)堿(jian)裂(lie)解(jie)、高(gao)鹽(yan)、低 pH 處(chu)理，質(zhi)粒可從(cong)菌體中(zhong)釋(shi)放(fang)出來，並特(te)異、高(gao)效地(di)被(bei)離(li)心吸(xi)附柱(zhu)吸附。通過(guo)清(qing)洗液的洗滌(di)可去(qu)除(chu)雜(za)質(zhi)，在(zai)低(di)鹽(yan)、高(gao) pH 條(tiao)件(jian)下洗脫(tuo)，最後得到純度較(jiao)高(gao)的質(zhi)粒 DNA。所得質(zhi)粒可直(zhi)接用(yong)於酶(mei)切(qie)、轉(zhuan)化、PCR、RT-qPCR、測(ce)序(xu)及(ji)轉(zhuan)染等分(fen)子生(sheng)物(wu)學實(shi)驗。

註意事項：

1.        通常(chang)酵(jiao)母(mu)的(de)拷(kao)貝數(shu)都(dou)很低(di)，高(gao)拷貝最(zui)大(da)得率(lv)壹般為每(mei) 5 ml 培(pei)養物(wu)提(ti)取 1 μg 左(zuo)右的質(zhi)粒。用(yong)於下(xia)遊(you)試(shi)驗時通常(chang)建(jian)議(yi)使(shi)用(yong)量(liang)為：1-5 μl 用(yong)做 PCR 模板(ban);5-10 μl 用(yong)於轉(zhuan)化大腸(chang)桿菌,選(xuan)擇(ze)高(gao)效率(lv)的(de)感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)。

2.  用(yong)戶(hu)需要自備 Sorbitol buffer( 1M 山(shan)li醇(chun)， 0.1M Na2EDTA，14 mM β-巰基乙(yi)醇(chun))。 配制(zhi)方(fang)法：在 600 ml 去(qu)離(li)子水裏面(mian)溶(rong)解(jie) 182.2 克(ke)山li醇(chun)，加入(ru) 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不(bu)需要調(tiao)節(jie) PH 值(zhi)，定(ding)容到 1L，4℃保存。臨(lin)用(yong)前(qian)加 0.1%β-巰基乙(yi)醇(chun)(商(shang)品化的 β-巰基乙(yi)醇(chun)摩(mo)爾(er)濃(nong)度壹般為 14M)。

3.         使(shi)用(yong)前(qian)請先檢查平(ping)衡(heng)液、溶(rong)液 YP2 和(he)溶(rong)液 YP3 是(shi)否出現渾(hun)濁(zhuo)，如有(you)混濁(zhuo)現象，可在(zai) 37℃

水浴中加熱幾分鐘(zhong)，即(ji)可恢復澄清(qing)。

4.     溶(rong)液YP1，YP2 和(he)YP3 的(de)用(yong)量(liang)比(bi)例(li)，若(ruo)細(xi)菌量(liang)增(zeng)大(da)，需按(an)比(bi)例(li)放(fang)大這些(xie)溶(rong)液的使(shi)用(yong)量(liang)；

重(zhong)要提示：

壹、第壹次(ci)使(shi)用(yong)前(qian)請先在去(qu)蛋白(bai)液 PD、漂(piao)洗液 WB 中(zhong)加入(ru)指ding量(liang)無水乙(yi)醇(chun)（見瓶身(shen)標(biao)簽），充分(fen)混勻，並做好(hao)標記，以(yi)免(mian)多次(ci)加(jia)入(ru)。

二(er)、首(shou)ci使(shi)用(yong)時請先將 RNase A 全(quan)部加到(dao)溶(rong)液YP1 中(zhong)，混勻，每次(ci)使(shi)用(yong)後置於 2 ~ 8℃保存。三(san)、吸取使(shi)用(yong)量(liang)的Sorbitol buffer 加(jia)入(ru) 0.1%β-巰基乙(yi)醇(chun)，回(hui)復到室(shi)溫備用(yong)。

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1.   取 100 - 180 ml 酵(jiao)母(mu)培(pei)養(yang)物(wu)，12,000 x g 離(li)心 1 min，盡可能(neng)的吸(xi)棄(qi)上(shang)清(qing)，收集菌(jun)體。

（註意： 如(ru)果用(yong) 50ml 離(li)心管(guan)收(shou)集菌(jun)體，可以(yi)離(li)心棄(qi)上(shang)清(qing)後，在同壹管內加(jia)入(ru)更多(duo)的(de)菌(jun)液，重復步(bu)驟(zhou)

1，直(zhi)到收集到(dao)足(zu)夠(gou)多的(de)菌(jun)體）

2. 加(jia)入(ru) 10 ml Sorbitol buffer，輕柔吹(chui)打充分(fen)重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞(bao)；加(jia)入(ru) 0.1 g Lyticase (Lyticase 臨(lin)用(yong)前(qian)用(yong) 2ml Sorbitol buffer 溶(rong)解(jie))，充分(fen)顛(dian)倒(dao)混勻，37℃溫育 1 – 2 小時消化細(xi)胞(bao)壁，中間(jian)可顛(dian)倒(dao)數(shu)次(ci)幫(bang)助(zhu)消(xiao)化。

（註意：如(ru)果破壁效果不好導致質(zhi)粒產量(liang)低，可以(yi)加大(da) lyicase 用(yong)量(liang)來提(ti)高(gao)酶工(gong)作(zuo)濃(nong)度，還(hai)可以(yi)延(yan)長(chang)消(xiao)化時間(jian)來(lai)提(ti)高(gao)效果，不適合(he) Lyticase 消(xiao)化的酵(jiao)母(mu)可選(xuan)用(yong) Zymolase 或(huo)者其它(ta)方(fang)法如玻璃珠(zhu)渦旋，反復凍(dong)融等(deng)。）

3.       12,000 x g 離(li)心 2 min，盡可能(neng)吸棄(qi)上(shang)清(qing)，加入(ru) 7 ml 溶(rong)液YP1，重(zhong)懸(xuan)菌(jun)體沈澱，渦旋震

蕩(dang)至徹(che)di懸(xuan)浮。

（註意：如(ru)有(you)未(wei)徹(che)di懸(xuan)浮的菌塊(kuai)會(hui)影響(xiang)裂(lie)解(jie)，導致提(ti)取的(de)質(zhi)粒濃(nong)度及(ji)純(chun)度降(jiang)低）

4.  加(jia)入(ru) 7 ml 溶(rong)液YP2，溫和(he)地(di)上(shang)下翻轉(zhuan) 6-8 次(ci)，使(shi)菌體充分(fen)裂(lie)解(jie)，室(shi)溫放(fang)置 4 min。

（註意：不(bu)可劇(ju)烈(lie)震蕩(dang)，以(yi)免(mian)造成基因(yin)組(zu) DNA 片段(duan)的(de)汙染(ran)，所用(yong)時間(jian)不(bu)要超過 5 min，以(yi)免(mian)質(zhi)粒受(shou)到破壞(huai)，如未(wei)完quan變(bian)得清(qing)亮(liang)，可能(neng)是菌(jun)體太(tai)多，可增(zeng)加(jia)溶(rong)液 P2 的(de)用(yong)量(liang)，在後續(xu)的(de)操(cao)作(zuo)中(zhong)溶(rong)液 YP3 的(de)用(yong)量(liang)也(ye)要相應增(zeng)加(jia)）

5.  加(jia)入(ru) 10 ml 溶(rong)液YP3，立(li)即溫和(he)地(di)上(shang)下翻轉(zhuan) 6-8 次(ci)，充分(fen)混勻時會出(chu)現白(bai)色絮狀沈澱，

然(ran)後室(shi)溫 12,000 x g 離(li)心 10 -15 min, 小心取上(shang)清(qing)，避免(mian)吸到(dao)白(bai)色漂浮物(wu)。

（註意：加(jia)入(ru)溶(rong)液 YP3 後應立即混合(he)，避免(mian)產生 SDS 的(de)局部沈澱,如(ru)果上(shang)清(qing)中還(hai)有(you)白(bai)色漂浮物(wu)，可再(zai)次(ci)離(li)心取上(shang)清(qing)）

6.        將(jiang)上(shang)清(qing)液加入(ru)吸附柱(zhu)中（吸(xi)附柱(zhu)最大(da)容量(liang) 10ml），室(shi)溫 12,000 rpm 離(li)心 1 min，質(zhi)粒被(bei)

吸(xi)附在(zai)膜上(shang)，棄濾(lv)液。重復步(bu)驟(zhou)直到上(shang)清(qing)全(quan)部被(bei)加(jia)入(ru)吸附柱(zhu)。

7.        可選(xuan)步(bu)驟(zhou)：向(xiang)吸(xi)附柱(zhu)中加(jia)入(ru) 10 ml 去(qu)蛋白(bai)液 PD，室(shi)溫 12,000 x g 離(li)心 1 min，棄(qi)濾(lv)液。

8.  加(jia)入(ru) 10 ml 漂(piao)洗液 WB，室(shi)溫 12,000 x g 離(li)心 1 min，棄(qi)濾(lv)液。

（註意：漂(piao)洗液 WB 為(wei)濃(nong)縮(suo)液，按(an)要求加入(ru)無水乙(yi)醇(chun)，用(yong)後應立即蓋緊(jin)瓶蓋，以(yi)防酒(jiu)精揮(hui)發(fa)）

9. 重(zhong)復步(bu)驟(zhou) 8 壹次(ci)。

10.      室(shi)溫 12,000 x g 離(li)心 2 min，甩幹膜上(shang)殘留(liu)乙(yi)醇(chun)。打開(kai)蓋子室(shi)溫晾幹 2 – 3 min。

（註意：此(ci)步(bu)不能(neng)省略(lve)，否則(ze)殘留(liu)乙(yi)醇(chun)會影響(xiang)質(zhi)粒的後續(xu)使(shi)用(yong)）

11.     將(jiang)吸附柱(zhu)置於壹個新的 50 ml 離(li)心管(guan)（自(zi)備(bei)）中(zhong)，加入(ru) 0.6 - 1ml 的(de)洗脫(tuo)緩沖(chong)液EB，室(shi)溫放(fang)置 2 min，12,000 rpm 離(li)心 2 min，離(li)心管(guan)底溶(rong)液即質(zhi)粒 DNA。

（註意：事先在 65~70℃水浴中預(yu)熱洗脫(tuo)緩沖(chong)液 EB，可增(zeng)加(jia)洗脫(tuo)效率(lv)；如(ru)果需要較多量(liang)質(zhi)粒，可將(jiang)得到的溶(rong)液重新加入(ru)吸附柱(zhu)中，再(zai)次(ci)離(li)心 1 min 收(shou)集；如(ru)需使(shi)用(yong)去(qu)離(li)子水洗脫(tuo)，可用(yong) NaOH 調(tiao)整(zheng)其(qi) pH值(zhi)在(zai) 7.0 - 8.5 之間(jian)。）

酵(jiao)母(mu)高(gao)純度質(zhi)粒大提(ti)試(shi)劑(ji)盒 核(he)酸提取