本產品(pin)采用 Poly（A）加(jia)尾法(fa)，以 miRNA 為(wei)模板，采用特殊優化(hua)預(yu)混(hun)合 miRNA RT Enzyme mix（包(bao)含Poly(A)加(jia)尾酶和(he)反轉錄(lu)酶）將(jiang) Poly(A)加(jia)尾和(he)反轉錄(lu)壹(yi)步(bu)法(fa)高(gao)效完成 miRNA 對(dui)應(ying)的 cDNA 合(he)成；miRNA 檢(jian)測使(shi)用 2 x miRNA qPCR Mix（含(han)有(you)通用型(xing) ROX）。
miRNA反轉錄(lu)/熒(ying)光定量(liang)檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒(he)

諾(nuo)博萊德 miRNA反轉錄(lu)/熒(ying)光定量(liang)檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒(he)

miRNA RT-qPCR Detection kitmiRNA 反轉錄(lu)/熒(ying)光定量(liang)檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒(he)（All In One）

目(mu)錄(lu)號(hao):71613

產(chan)品(pin)內容

保(bao)存(cun)條件(jian)

-20℃保(bao)存(cun)，有效期(qi) 12 個月(yue)。

具(ju)體(ti)產(chan)品(pin)的參數以(yi)收到(dao)產品(pin)說明書的參數為(wei)準(zhun)

產(chan)品(pin)簡介

本產品(pin)包含(han)25 rxns (20 μl/rxn) 的(de)miRNA逆轉(zhuan)錄（加(jia)尾法(fa)）和(he)500 rxns (20 μl/rxn)的(de)2x miRNA qPCR Mix。

本產品(pin)采用 Poly（A）加(jia)尾法(fa)，以 miRNA 為(wei)模板，采用特殊優化(hua)預(yu)混(hun)合 miRNA RT Enzyme mix（包(bao)含Poly(A)加(jia)尾酶和(he)反轉錄(lu)酶）將(jiang) Poly(A)加(jia)尾和(he)反轉錄(lu)壹(yi)步(bu)法(fa)高(gao)效完成 miRNA 對(dui)應(ying)的 cDNA 合(he)成；miRNA 檢(jian)測使(shi)用 2 x miRNA qPCR Mix（含(han)有(you)通用型(xing) ROX）。適用於(yu) Total RNA 或(huo)者 small RNA 等包(bao)含(han) miRNA 的樣(yang)品(pin)。

操作步(bu)驟：

壹(yi)、miRNA 3’末端(duan)進(jin)行Poly (A)加(jia)尾 和(he) 逆轉(zhuan)錄反應（第(di)壹(yi)鏈合(he)成）

1. 冰(bing)上，在(zai) RNase-Free PCR 管中，加(jia)入(ru)以(yi)下(xia)組(zu)分(fen)：(先(xian)加(jia)其他(ta)組分(fen)，最(zui)後(hou)再(zai)加(jia)入(ru) miRNA RT Enzyme Mix)

註(zhu)意事項：miRNA RT Enzyme Mix非(fei)常(chang)粘稠，溶液(ye)容易(yi)吸附在(zai)管壁和(he)吸(xi)頭外，導致損(sun)失(shi)，用前(qian)請(qing)點(dian)甩離心(xin)，並(bing)且避免(mian)吸(xi)頭外壁沾附損(sun)失(shi)。Enzyme Mix內酶都是過量(liang)的，即(ji)使每(mei)次(ci)按(an)照(zhao) 1.8μl使(shi)用，也不影(ying)響使(shi)用效果(guo)。

*在(zai)反應中使用的(de)total RNA 必(bi)須(xu)包(bao)含有(you)小(xiao)分(fen)子RNA(miRNA)。此(ci)過(guo)程(cheng)也可(ke)以(yi)使用富(fu)集的(de)miRNA，單(dan)純(chun)miRNA無(wu)法(fa)直接(jie)用分(fen)光光度計(ji)定(ding)量(liang)，建(jian)議(yi)直接(jie)加(jia)入(ru)2μl ~5μl。可(ke)根(gen)據(ju)目(mu)的(de)miRNA豐(feng)度決定加(jia)入(ru)量(liang)，但(dan)是對於低豐(feng)度miRNA 樣(yang)品(pin)而言(yan)(如(ru)血(xue)清(qing)血(xue)漿(jiang)提(ti)取(qu)物)，可(ke)直(zhi)接(jie)加(jia)入(ru)最(zui)大體(ti)積(ji)8 μl。

2. 輕(qing)柔(rou)吸(xi)打混(hun)勻(yun)，點(dian)甩離心(xin)，42℃孵育(yu)60 min，進(jin)行miRNA加(jia)尾和(he)逆轉(zhuan)錄反應。

3. 85℃加(jia)熱(re)5 sec，終止(zhi)反應。合(he)成的(de)cDNA反應液(ye)可(ke)放(fang)置於-20°C保存(cun)；也可(ke)以(yi)直接(jie)進(jin)行下(xia)遊qPCR檢(jian)測。

二、進(jin)行miRNA的(de)熒(ying)光定量(liang)檢(jian)測。

Forward Primer設(she)計(ji)原(yuan)則：(上遊引(yin)物(wu)需(xu)要自(zi)備）

1. 遵(zun)循(xun)引(yin)物(wu)設計(ji)的(de)最(zui)pu遍(bian)原(yuan)則。

2. 以(yi)成熟(shu)的(de)miRNA 序列為(wei)基(ji)礎，將(jiang)U替(ti)換(huan)成T，這(zhe)是最基礎和(he)最(zui)jian單(dan)的設(she)計(ji)方(fang)法(fa)。

3. 試(shi)劑(ji)盒(he)中提供的下(xia)遊引(yin)物(wu)的Tm 值(zhi)為65℃，設計(ji)上遊引(yin)物(wu)的Tm 值(zhi)要盡(jin)量(liang)保證(zheng)在(zai)65℃左(zuo)右。

4. 若(ruo)按(an)照(zhao)原(yuan)則2 的(de)方(fang)式(shi)直(zhi)接(jie)設計(ji)的(de)引(yin)物(wu)其Tm 值(zhi)過低(di)，可(ke)以(yi)在(zai)引(yin)物(wu)的5’端(duan)添(tian)加(jia)幾(ji)個堿(jian)基(ji)（最(zui)好(hao)為G 或C 堿基）；也可(ke)以(yi)在(zai)3’端添(tian)加(jia)1個或(huo)幾(ji)個A堿(jian)基(ji)；或(huo)者5’端和(he)3’端(duan)同(tong)時(shi)修(xiu)飾。

5. 若(ruo)按(an)照(zhao)原(yuan)則2 的(de)方(fang)式(shi)直(zhi)接(jie)設計(ji)的(de)引(yin)物(wu)其Tm 值(zhi)過高(gao)，可(ke)以(yi)在(zai)引(yin)物(wu)的5’或(huo)3’端去掉(diao)幾(ji)個堿(jian)基(ji)。

操作步(bu)驟：

1. 冰(bing)上配制qPCR反應體(ti)系(xi)：（以(yi)20μl反應體(ti)系(xi)為(wei)例）

1） 推(tui)薦模板加(jia)樣(yang)量(liang)為1-2μl，miRNA 第(di)壹(yi)鏈cDNA不應(ying)超過(guo)總反應體(ti)系(xi)的(de)10%，對(dui)於(yu)特殊的(de)檢(jian)測體(ti)系(xi)中，高(gao)含(han)量(liang)的cDNA模板易(yi)導致(zhi)非(fei)特異(yi)性(xing)擴(kuo)增，根(gen)據(ju)所(suo)檢(jian)測miRNA的(de)豐(feng)度適當的(de)稀釋(shi)cDNA（10倍(bei)或(huo)者100倍(bei)）。

2） 通常推(tui)薦引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)為(wei)0.2 μM，就(jiu)可(ke)以(yi)得(de)到較(jiao)好(hao)的結果(guo)，反應效果(guo)不佳(jia)時(shi)可(ke)在(zai)0.1 - 1.0 μM範(fan)圍(wei)內進(jin)行調(tiao)整(zheng)。擴(kuo)增效率(lv)不高(gao)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)，可(ke)提(ti)高(gao)引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)；發(fa)生(sheng)非(fei)特異(yi)性(xing)反應時(shi)，可(ke)降(jiang)低引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)，由(you)此(ci)優化(hua)反應體(ti)系(xi)。

2. qPCR反應程(cheng)序

二步(bu)法(fa)特異(yi)性(xing)高(gao)，三步(bu)法(fa)擴(kuo)增效率(lv)高(gao)。

如(ru)果(guo)融(rong)鏈曲(qu)線(xian)較(jiao)差，可(ke)以(yi)嘗試(shi)兩(liang)步(bu)法(fa)擴(kuo)增或(huo)提(ti)高(gao)退火溫度；如(ru)果(guo)因使用Tm值(zhi)較(jiao)低的(de)引(yin)物(wu)等原(yuan)因，得(de)不到(dao)良好(hao)的實驗結果(guo)時(shi)，可(ke)嘗(chang)試(shi)加(jia)長延(yan)伸時(shi)間(jian)或(huo)者進(jin)行三步(bu)法(fa)PCR擴(kuo)增。

miRNA反轉錄(lu)/熒(ying)光定量(liang)檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒(he)