miRNA Real-Time PCR Assay kit 采(cai)用 SYBR Green I 嵌合染料(liao)法(fa)的(de)原(yuan)理(li)進行 miRNA 熒光(guang)定(ding)量檢測(ce)。
其中2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix是專(zhuan)門為(wei)miRNA 定(ding)量檢測(ce)而(er)研(yan)發(fa)的(de)新壹(yi)代(dai)2x預(yu)混(hun)液，包含除(chu)引(yin)物和(he) DNA 樣品(pin)以外(wai)的(de)所有qPCR 組分(fen)，可(ke)減(jian)少(shao)操(cao)作步(bu)驟(zhou)
miRNA熒光(guang)定(ding)量PCR檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒（加(jia)尾(wei)法）

諾(nuo)博萊德 miRNA熒光(guang)定(ding)量PCR檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒（加(jia)尾(wei)法）

miRNA Real-Time PCR Assay kitmiRNA 熒光(guang)定(ding)量 PCR 檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒

目(mu)錄(lu)號：71419

產品內容

保(bao)存條件(jian)

-20℃保(bao)存，有效期 24 個月。

qPCR Mix 使用前(qian)，充(chong)分(fen)融解(jie)，輕(qing)柔(rou)顛倒(dao)混(hun)勻，短期使用可(ke)放(fang)在(zai) 4 ℃，避免反復凍融。

Reverse primer(10μM )每次(ci)用完置(zhi)-20 ℃保(bao)存。

具體產品的(de)參(can)數(shu)以收(shou)到產品說明(ming)書(shu)的(de)參(can)數(shu)為準(zhun)

產品簡介

miRNA Real-Time PCR Assay kit 采(cai)用 SYBR Green I 嵌合染料(liao)法(fa)的(de)原(yuan)理(li)進行 miRNA 熒光(guang)定(ding)量檢測(ce)。

其中2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix是專(zhuan)門為(wei)miRNA 定(ding)量檢測(ce)而(er)研(yan)發(fa)的(de)新壹(yi)代(dai)2x預(yu)混(hun)液，包含除(chu)引(yin)物和(he) DNA 樣品(pin)以外(wai)的(de)所有qPCR 組(zu)分(fen)，可(ke)減(jian)少(shao)操(cao)作步(bu)驟(zhou)，縮短加(jia)樣時間，降(jiang)低汙染幾(ji)率。其核心(xin)組分(fen)是全新的(de) Hotmaster Taq DNA 聚(ju)合酶，配合精心(xin)優(you)化的(de) Buffer 體(ti)系(xi)，有效抑(yi)制(zhi)非(fei)特(te)異性擴增(zeng)，可(ke)對(dui)寬廣濃(nong)度範(fan)圍(wei)的(de)模(mo)板進行準確定(ding)量，獲得穩(wen)定(ding)可(ke)靠(kao)的(de) qPCR 結(jie)果(guo)，具有靈敏(min)度(du)高(gao)、特(te)異性強、穩(wen)定(ding)性好(hao)等(deng)特(te)點(dian)。

預(yu)混(hun)液中含有通(tong)用型(xing)ROX，適用於(yu)所有qPCR儀(yi)，使用qPCR Mix時不需(xu)要(yao)額(e)外(wai)添加(jia)ROX來(lai)校(xiao)正儀(yi)器。

註意(yi)：該(gai)試(shi)劑(ji)盒需(xu)要(yao)與增(zeng)強型miRNA cDNA 第壹(yi)鏈(lian)合成試(shi)劑(ji)盒（加(jia)尾(wei)法）（Cat# P418-25）配(pei)套使用。

1. 需(xu)要(yao)自備的(de)試(shi)劑(ji)：待(dai)檢測(ce)miRNA對(dui)應的(de)qPCR上(shang)遊引(yin)物（Forward primer）

2. 待(dai)檢測(ce)miRNA對(dui)應的(de)qPCR上(shang)遊引(yin)物（Forward primer）

Forward Primer設(she)計(ji)原則：

1. 遵循引(yin)物設(she)計(ji)的(de)最(zui)pu遍(bian)原則(ze)。

2. 以成熟(shu)的(de)miRNA 序列為(wei)基(ji)礎，將(jiang)U 替(ti)換(huan)成T，這是最基(ji)礎和(he)最jian單(dan)的(de)設(she)計(ji)方法(fa)。

3. 試(shi)劑(ji)盒中提供(gong)的(de)下(xia)遊引(yin)物的(de)Tm 值(zhi)為(wei)65℃，設(she)計(ji)上遊引(yin)物的(de)Tm 值(zhi)要(yao)盡(jin)量保證在(zai)65℃左右。

4. 若(ruo)按照(zhao)原(yuan)則(ze)2 的(de)方式(shi)直接設(she)計(ji)的(de)引(yin)物其Tm 值(zhi)過(guo)低(di)，可(ke)以在(zai)引(yin)物的(de)5’端(duan)添(tian)加(jia)幾(ji)個堿基(ji)（最好(hao)為(wei)G 或C 堿(jian)基(ji)）；也可(ke)以在(zai)3’端(duan)添加(jia)1 個或幾(ji)個A 堿基(ji)；或者5’端和(he)3’端(duan)同(tong)時修飾(shi)。

5. 若按照(zhao)原(yuan)則(ze)2 的(de)方式(shi)直接設(she)計(ji)的(de)引(yin)物其Tm 值(zhi)過(guo)高(gao)，可(ke)以在(zai)引(yin)物的(de)5’或(huo)3’端(duan)去(qu)掉(diao)幾(ji)個堿基(ji)。

操作步(bu)驟(zhou)：

1. 將(jiang)DNA模板、引(yin)物、2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H2O溶(rong)解(jie)並(bing)置(zhi)冰上備(bei)用。

2. 使用時請將2 x miRNA qPCR Mix上下(xia)顛倒(dao)輕(qing)輕(qing)均(jun)勻混合，避免起(qi)泡(pao)，並經(jing)輕微(wei)離(li)心(xin)後使(shi)用。

3. 冰上配(pei)制qPCR反應體系(xi)：（以20μl反應體系(xi)為例）

1） 推(tui)薦模板加(jia)樣量為1-2μl / 20μl反應體系(xi)，miRNA 第壹(yi)鏈(lian)cDNA不(bu)應超(chao)過(guo)總(zong)反應體系(xi)的(de)10%，對(dui)於(yu)特(te)殊的(de)檢測(ce)體(ti)系(xi)中，高(gao)含量的(de)cDNA 模(mo)板易(yi)導(dao)致(zhi)非(fei)特(te)異性擴增(zeng)，根(gen)據(ju)所檢測(ce)miRNA 的(de)豐(feng)度適當的(de)稀(xi)釋cDNA（10倍或(huo)者100倍）。

2） 本(ben)品(pin)中含有熒光(guang)染料(liao)Sybr Green I，保存本(ben)品(pin)或配(pei)制PCR反應液時應避免強(qiang)光(guang)照(zhao)射(she)。

3） 通(tong)常推(tui)薦引(yin)物濃(nong)度為(wei)0.2 μM，就可(ke)以得到較(jiao)好(hao)的(de)結(jie)果(guo)，反應效果(guo)不(bu)佳(jia)時可(ke)在(zai)0.1 - 1.0 μM範(fan)圍(wei)內(nei)進行調整。擴增(zeng)效率不(bu)高(gao)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)，可(ke)提(ti)高(gao)引(yin)物濃(nong)度；發(fa)生(sheng)非(fei)特(te)異性反應時，可(ke)降(jiang)低引(yin)物濃(nong)度，由此優(you)化反應體系(xi)。

4. qPCR反應程序

註(zhu)意(yi)：

1） 絕大多數(shu)情況(kuang)下(xia)，使用二步(bu)法(fa)或(huo)三步(bu)法(fa)均(jun)可(ke)獲得良好效果(guo)。二步(bu)法(fa)擴(kuo)增(zeng)特(te)異性高(gao)，三步(bu)法(fa)擴(kuo)增(zeng)效率高(gao)。如果(guo)融(rong)鏈(lian)曲(qu)線較(jiao)差(cha)，可(ke)以嘗(chang)試(shi)兩(liang)步(bu)法(fa)擴(kuo)增(zeng)或提高(gao)退火(huo)溫(wen)度(du)；如(ru)果(guo)因(yin)使(shi)用Tm值(zhi)較(jiao)低(di)的(de)引(yin)物等(deng)原因，得不到良好的(de)實驗結(jie)果(guo)時，可(ke)嘗(chang)試加(jia)長延(yan)伸(shen)時間或者進行三步(bu)法(fa)PCR擴增(zeng)。

2） 根(gen)據(ju)引(yin)物的(de)Tm值(zhi)進行退火(huo)&延(yan)伸（退火(huo)）溫(wen)度(du)的(de)設(she)定(ding)；

3） 延伸(shen)（退火(huo)&延(yan)伸）時間的(de)設(she)置(zhi)還(hai)需(xu)要(yao)根(gen)據(ju)您所使用的(de)qPCR儀(yi)所需(xu)要(yao)的(de)最(zui)短(duan)數(shu)據(ju)采(cai)集(ji)時間自行調整。

4） 融解(jie)曲(qu)線分(fen)析請(qing)以所使用的(de)熒光(guang)定(ding)量PCR儀(yi)推薦的(de)程(cheng)序進行設(she)定(ding)。

miRNA熒光(guang)定(ding)量PCR檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒（加(jia)尾(wei)法）