2x miRNA Universal SYBR qPCR Mix（莖(jing)環法(fa)）是專(zhuan)門為莖(jing)環法(fa)miRNA定量(liang)檢(jian)測(ce)而研發(fa)的(de)新壹代預(yu)混(hun)形(xing)式(shi)的熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR檢(jian)測(ce)試劑，其(qi)中(zhong)的(de)DNA polymerase 采用(yong)的是(shi)抗體(ti)修(xiu)飾的(de)熱(re)啟動形(xing)式(shi)， 配合(he)特殊的(de)Buffer 體(ti)系，使(shi)反應特異(yi)性(xing)更(geng)好(hao)，靈(ling)敏度更高，並能(neng)在更廣(guang)的範(fan)圍內(nei)進行(xing)準(zhun)確定量(liang)。
miRNA Universal SYBR qPCR Mix 熒(ying)光(guang)定量(liang)

諾博(bo)萊德 miRNA Universal SYBR qPCR Mix  熒(ying)光(guang)定量(liang)

2x miRNAUniversal SYBR qPCR Mix (莖(jing)環法(fa))

目錄(lu)號(hao):71501

產品(pin)內(nei)容(rong)

保存條(tiao)件(jian)

-20℃保存，有效(xiao)期(qi) 24 個月(yue)。

使(shi)用(yong)前，充(chong)分(fen)融(rong)解(jie)，輕輕顛倒混(hun)勻(yun)，短(duan)期(qi)使(shi)用(yong)可放在 4 ℃，避免反復(fu)凍(dong)融(rong)。

具體(ti)產品(pin)的參數(shu)以(yi)收(shou)到(dao)產(chan)品(pin)說明書(shu)的參數(shu)為準(zhun)

產品(pin)簡介

2x miRNA Universal SYBR qPCR Mix（莖(jing)環法(fa)）是專(zhuan)門為莖(jing)環法(fa)miRNA定量(liang)檢(jian)測(ce)而研發(fa)的(de)新壹代預(yu)混(hun)形(xing)式(shi)的熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR檢(jian)測(ce)試劑，其(qi)中(zhong)的(de)DNA polymerase 采用(yong)的是(shi)抗體(ti)修(xiu)飾的(de)熱(re)啟動形(xing)式(shi)， 配合(he)特殊的(de)Buffer 體(ti)系，使(shi)反應特異(yi)性(xing)更(geng)好(hao)，靈(ling)敏度更高，並能(neng)在更廣(guang)的範(fan)圍內(nei)進行(xing)準(zhun)確定量(liang)。

預混(hun)液中(zhong)含(han)有通用(yong)型ROX，適用(yong)於所有qPCR儀(yi)，使(shi)用(yong)qPCR Mix時不(bu)需(xu)要額(e)外添加ROX來(lai)校正(zheng)儀(yi)器(qi)。

需(xu)要自備的(de)試劑：

待檢(jian)測(ce)miRNA對(dui)應的qPCR的(de)引(yin)物(wu)

Realtime 上遊(you)引(yin)物(wu)設(she)計：

miRNA序列(lie)除(chu)去(qu)3’端6個堿基 的(de)剩(sheng)余部(bu)分(fen)作(zuo)為上遊(you)引(yin)物(wu)，如miR-1的(de)上(shang)遊(you)引(yin)物(wu)為(註意(yi) 把U改(gai)為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢(jian)查(zha)引(yin)物(wu)的(de)Tm 值（壹般參(can)考DNAMAN），如果(guo)Tm值較低，則(ze)在5’端加GC使(shi)Tm值接(jie)近(jin)60度。因此miR-1的(de)上遊(you)引(yin)物(wu)可設(she)計 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

下(xia)遊(you)引(yin)物(wu)是(shi)通用(yong)的，序列(lie)為GTGCAGGGTCCGAGGT。

引(yin)物(wu)設(she)計好後(hou)，需(xu)要通過(guo)預(yu)試驗檢(jian)測(ce)引(yin)物(wu)的(de)特(te)異性(xing)。壹般需(xu)要做溶(rong)解(jie)曲(qu)線來(lai)檢(jian)測(ce)引(yin)物(wu)的(de)特(te)異性(xing)；同時最好將(jiang)PCR產物(wu)進行(xing)電(dian)泳檢(jian)測(ce)產(chan)物(wu)是否(fou)單(dan)壹（產物(wu)長度(du)很(hen)短(duan)，需(xu)要3%以(yi)上(shang)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)膠）

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1. 在室溫融(rong)化(hua)2x miRNA qPCR Mix、primer（10μM）、DNA模(mo)板(ban)、ddH2O，並置於冰上(shang)備用(yong)。

2. 冰上(shang)配制(zhi)qPCR反應體(ti)系：（以(yi)20μl反(fan)應體(ti)系為例）

1） 推(tui)薦(jian)模(mo)板(ban)加樣(yang)量(liang)為1-2μl / 20μl反應體(ti)系，cDNA原液(ye)≤總(zong)反(fan)應體(ti)系的(de)10%。

2） 對(dui)於特(te)殊的(de)檢(jian)測(ce)體(ti)系中(zhong)，高含量(liang)的cDNA 模(mo)板(ban)易導(dao)致(zhi)非(fei)特異(yi)性(xing)擴(kuo)增(zeng)，根據所檢(jian)測(ce)miRNA 的(de)豐度適當的(de)稀釋cDNA（10倍(bei)或者(zhe)100倍）。

3） 通常推(tui)薦(jian)引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)為0.2 μM，就(jiu)可以(yi)得(de)到(dao)較好的(de)結(jie)果(guo)，反應效(xiao)果不(bu)佳(jia)時(shi)可在0.1 - 1.0 μM範圍內(nei)進行(xing)調(tiao)整(zheng)。

擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率不(bu)高的情(qing)況(kuang)下(xia)，可提高引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)；發生(sheng)非特(te)異(yi)性(xing)反(fan)應時，可降低引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)，由此優(you)化反(fan)應體(ti)系。

3. qPCR反應程序

註意(yi)：

1） 本產(chan)品(pin)兼(jian)容(rong)性(xing)強(qiang)，絕(jue)大(da)多數(shu)情(qing)況(kuang)下(xia)使(shi)用(yong)二步(bu)法(fa)和三(san)步(bu)法(fa)均可獲(huo)得(de)良好效(xiao)果。壹般來(lai)說，二(er)步(bu)法(fa)擴(kuo)增(zeng)特異性(xing)高，三步(bu)法(fa)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率高。如果(guo)融(rong)鏈(lian)曲(qu)線較差，可以(yi)嘗(chang)試兩步(bu)法(fa)擴(kuo)增(zeng)或提高退(tui)火(huo)溫度(du)；如果(guo)因使(shi)用(yong)Tm值較低的引(yin)物(wu)等(deng)原因，得(de)不(bu)到(dao)良好的(de)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)時，可嘗試加長延(yan)伸(shen)時間或者(zhe)進行(xing)三(san)步(bu)法(fa)PCR擴(kuo)增(zeng)。

2） 根據引(yin)物(wu)的(de)Tm值進行(xing)退(tui)火(huo)&延(yan)伸(shen)（退(tui)火(huo)）溫度(du)的(de)設(she)定(ding)；

3） 延(yan)伸(shen)（退(tui)火(huo)&延(yan)伸(shen)）時間的設(she)置還需(xu)要根據您所使(shi)用(yong)的qPCR儀(yi)所需(xu)要的最短數(shu)據采集(ji)時間自行調(tiao)整(zheng)。

4） 融(rong)解(jie)曲(qu)線分(fen)析請以(yi)所使(shi)用(yong)的熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR儀推(tui)薦(jian)的(de)程序進行(xing)設(she)定(ding)。

miRNA Universal SYBR qPCR Mix  熒(ying)光(guang)定量(liang)