可(ke)在室溫(wen)條件(jian)下(xia)，20分(fen)鐘(zhong)完成(cheng)TA克(ke)隆(long)或Blunt克(ke)隆(long)，陽(yang)性率(lv)接(jie)近(jin)100%，並且(qie)免(mian)冰浴、免(mian)熱激、免(mian)藍(lan)白斑篩(shai)選(xuan)，還可(ke)以連接(jie)長(chang)達10kb的(de)DNA片段。
TOPO-TA Lightning Cloning Kit

TOPO-TA Lightning Cloning Kit

TOPO-TA Lightning Cloning Kit（含酶切位點）

目錄(lu)號(hao)：42114

產品(pin)內容：

保存(cun)條件(jian)：

-20℃，存(cun)放 12 個月，不(bu)影(ying)響使用效(xiao)果。

具(ju)體產品(pin)的(de)參數(shu)以收到(dao)產品說明(ming)書(shu)的(de)參數(shu)為(wei)準

產品(pin)簡(jian)介：

可(ke)在室溫(wen)條件(jian)下(xia)，20分(fen)鐘(zhong)完成(cheng)TA克(ke)隆(long)或Blunt克(ke)隆(long)，陽(yang)性率(lv)接(jie)近(jin)100%，並且(qie)免(mian)冰浴、免(mian)熱激、免(mian)藍(lan)白斑篩(shai)選(xuan)，還可(ke)以連接(jie)長(chang)達10kb的(de)DNA片段。

克隆(long)步(bu)驟（≤3kb 片段）：              

簡化(hua)步(bu)驟（≤10kb 片段）-- 免(mian)復蘇，免(mian)液體 LB

1、連接(jie)：室溫(wen) 5 分鐘(zhong)；                      1、連接(jie): 37℃連接(jie) 5 min。

2、轉化(hua)：室溫(wen) 5 分鐘(zhong)；                      2、轉化(hua)：冰浴 5 min，42℃熱激 1 min，冰上 2 min。

3、復蘇：180rpm、37℃振蕩培養 10 分鐘(zhong)；塗(tu)板。 3、取(qu)全(quan)部(bu)菌(jun)液塗板，37℃倒置(zhi)培養。

操作(zuo)步(bu)驟：

1.         PCR 產物的(de)制備(bei)：

a.       引(yin)物要(yao)求：引(yin)物不(bu)能磷酸(suan)化。

b.     酶的(de)選(xuan)擇：根(gen)據需要(yao)選(xuan)擇DNA 聚合(he)酶，該載(zai)體兼(jian)容PCR 產物的(de)A 末端(duan)和(he)平末端(duan)。

c.        電泳(yong)檢(jian)測 PCR 產物的(de)量和(he)質量：

①僅有目(mu)的(de)條帶，可(ke)直(zhi)接(jie)進行(xing)連接(jie)反(fan)應，無需(xu)純化(hua)；

②如果有(you)多條帶，建(jian)議(yi)凝膠(jiao)回(hui)收 DNA 片段（DC011-100）;

③如果以質(zhi)粒(li)為模(mo)板的(de)擴增，則(ze)必須(xu)進行(xing)凝膠(jiao)回(hui)收，因為(wei)模板質(zhi)粒(li)也(ye)會長(chang)出(chu)非(fei)目(mu)的(de)菌(jun)落。

2.         連接(jie)反(fan)應：

1）室溫(wen)（20℃-37℃）建立連接(jie)體系（10ul 體系）：

不同(tong)大(da)小(xiao)插入片(pian)段的(de)推(tui)薦(jian)用量：

加完試(shi)劑(ji)後，輕(qing)彈(dan)管底(di)混(hun)勻（或(huo)輕(qing)輕(qing)吹打混(hun)勻），點甩(shuai)離(li)心收集(ji)所有液體在離心(xin)管底(di)。

2) 室溫(wen)（20℃-37℃）連接(jie) 5 分鐘(zhong)。連接(jie)產(chan)物可(ke)直(zhi)接(jie)轉(zhuan)化(hua)感(gan)受態(tai)細(xi)胞，或置(zhi)於(yu)冰上備(bei)用。

3.         轉化(hua)、復蘇、塗板：

1）100ul 感(gan)受態(tai)細(xi)胞，置(zhi)於(yu)室溫(wen)解凍（約 1 分鐘(zhong)左(zuo)右），輕(qing)撣(dan)幾(ji)次(ci)將細胞均勻懸浮(fu)。

2）       加入 10ul 連接(jie)液，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻，室溫(wen)（20℃-37℃）放置(zhi) 5 分鐘(zhong)。

3）     加入 500ul 平衡(heng)至(zhi)室溫(wen)的(de) LB 或者(zhe) SOC 培養基(不含(han)抗(kang)生素(su))，37℃ 180 rpm 振蕩培養 10 min。

（註意：大(da)於(yu) 3kb 的(de)片段，振蕩培養時(shi)間(jian)延長(chang)至(zhi) 30-60 分鐘(zhong)，可(ke)以增(zeng)加轉化(hua)子(zi)。或(huo)者用簡(jian)化(hua)步(bu)驟）

4）        取(qu) 200l 菌(jun)液塗板(含氨芐(bian)qing黴(mei)素(su) 50-100ug/ml），培養過(guo)夜(ye)。（為(wei)得到(dao)較多克(ke)隆(long)，4000 rpm 離心(xin) 1 min，吸(xi)棄掉(diao)部(bu)分(fen)上(shang)清(qing)，保留(liu) 100-150ul，輕(qing)彈(dan)懸浮(fu)菌(jun)體，取(qu)全(quan)部(bu)菌(jun)液塗板）

註意：如(ru)果使(shi)用 5ul 體系，各成分按照比(bi)例減半，使用次(ci)數(shu)可(ke)以加倍(bei)。

4.         轉化(hua)子(zi)的(de)篩(shai)選(xuan)鑒定(ding)：

本制品陽(yang)性率(lv)相當高(gao)，壹(yi)般(ban)情(qing)況下(xia)，可(ke)以達到(dao)所見即(ji)所得，只要是長(chang)出(chu)來(lai)的(de)菌(jun)落正常(chang)（不(bu)是汙(wu)染的(de)雜(za)菌(jun)，轉化(hua)子(zi)數(shu)量也(ye)不算(suan)太少(shao)），基本就(jiu)包含(han)插入。因(yin)此插入片(pian)段不超(chao)過(guo) 2-3kb 的(de)情況下(xia)可(ke)以不(bu)用鑒定(ding)直接(jie)挑(tiao) 1-2 個菌(jun)去測序。

1）   菌(jun)落 PCR 檢測：挑單(dan)菌(jun)落於 10ul 無菌(jun)水(shui)中(zhong)，混(hun)勻，取(qu) 1ul 置(zhi)於(yu) 25ul PCR 體系,用 PCR 引(yin)物或(huo)者M13 通用引(yin)物去(qu)鑒定(ding)陽(yang)性克(ke)隆(long)。

2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引(yin)物測序來(lai)確定(ding)是(shi)否(fou)含有目(mu)的(de)克隆(long)。

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體圖譜(pu)：

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體序列：