可(ke)在(zai)室溫(wen)條件(jian)下，20分鐘(zhong)完(wan)成(cheng)TA克(ke)隆或(huo)Blunt克(ke)隆，陽性(xing)率接(jie)近100%，並(bing)且免冰(bing)浴(yu)、免(mian)熱(re)激(ji)、免藍(lan)白(bai)斑(ban)篩(shai)選，還(hai)可(ke)以(yi)連接長達(da)10kb的DNA片(pian)段。
TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit

諾博(bo)萊德 TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit

TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit（不含(han)酶切(qie)位(wei)點）

目錄(lu)號(hao)：42115

產品內容(rong)：

保(bao)存條(tiao)件：

-20℃，存(cun)放 12 個(ge)月，不影(ying)響(xiang)使(shi)用(yong)效果(guo)。

具體(ti)產(chan)品的參(can)數(shu)以(yi)收到產品說明書(shu)的(de)參數(shu)為(wei)準

產(chan)品簡介(jie)：

可(ke)在(zai)室溫(wen)條件(jian)下，20分鐘(zhong)完(wan)成(cheng)TA克(ke)隆或(huo)Blunt克(ke)隆，陽性(xing)率接(jie)近100%，並(bing)且免冰(bing)浴(yu)、免(mian)熱(re)激(ji)、免藍(lan)白(bai)斑(ban)篩(shai)選，還(hai)可(ke)以(yi)連接長達(da)10kb的DNA片(pian)段。

克隆步驟(zhou)（≤3kb 片(pian)段(duan)）：               

簡化步驟(zhou)（≤10kb 片段(duan)）-- 免復蘇(su)，免(mian)液(ye)體(ti) LB

1、連接：室溫(wen) 5 分鐘(zhong)；                      1、連接(jie): 37℃連(lian)接(jie) 5 min。

2、轉(zhuan)化：室(shi)溫 5 分鐘(zhong)；                      2、轉(zhuan)化：冰(bing)浴(yu) 5 min，42℃熱(re)激(ji) 1 min，冰上(shang) 2 min。

3、復蘇(su)：180rpm、37℃振(zhen)蕩(dang)培養 10 分鐘(zhong)；塗(tu)板。 3、取全(quan)部菌(jun)液塗板，37℃倒(dao)置(zhi)培(pei)養(yang)。

操作步驟(zhou)：

1.         PCR 產物(wu)的制(zhi)備(bei)：

a.       引物要(yao)求：引(yin)物(wu)不能磷酸化。

b.     酶的選擇(ze)：根(gen)據需(xu)要(yao)選擇(ze)DNA 聚(ju)合(he)酶，該(gai)載(zai)體(ti)兼(jian)容(rong)PCR 產物的(de)A 末(mo)端和(he)平末(mo)端。

c.        電(dian)泳(yong)檢(jian)測 PCR 產物(wu)的(de)量和(he)質量：

①僅(jin)有目的條帶(dai)，可(ke)直接(jie)進(jin)行連(lian)接反應，無需(xu)純(chun)化(hua)；

②如果(guo)有多(duo)條帶(dai)，建(jian)議(yi)凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;

③如果(guo)以(yi)質粒為(wei)模(mo)板的擴增，則必(bi)須進行凝膠回收，因(yin)為(wei)模(mo)板質粒(li)也(ye)會(hui)長出非(fei)目的菌(jun)落。

2.         連接(jie)反應：

1） 室(shi)溫(wen)（20℃-37℃）建(jian)立連(lian)接(jie)體系(xi)（10ul 體系(xi)）：

不同(tong)大(da)小(xiao)插入片段的(de)推薦(jian)用(yong)量：

加(jia)完試劑(ji)後(hou)，輕彈(dan)管底(di)混(hun)勻(yun)（或(huo)輕輕吹(chui)打混(hun)勻(yun)），點甩(shuai)離心(xin)收集所(suo)有液(ye)體在(zai)離心(xin)管底(di)。

2) 室溫（20℃-37℃）連(lian)接(jie) 5 分鐘(zhong)。連(lian)接產物(wu)可(ke)直接(jie)轉(zhuan)化感(gan)受(shou)態細(xi)胞，或(huo)置(zhi)於(yu)冰(bing)上(shang)備(bei)用(yong)。

3.         轉(zhuan)化、復(fu)蘇(su)、塗(tu)板：

1）100ul 感(gan)受(shou)態細(xi)胞，置(zhi)於(yu)室(shi)溫(wen)解凍（約(yue) 1 分鐘(zhong)左(zuo)右），輕撣幾(ji)次(ci)將(jiang)細(xi)胞均(jun)勻(yun)懸(xuan)浮。

2）      加(jia)入 10ul 連接液，輕輕(qing)混(hun)勻(yun)，室(shi)溫（20℃-37℃）放置(zhi) 5 分鐘(zhong)。

3）    加(jia)入 500ul 平衡至室溫的(de) LB 或者(zhe) SOC 培(pei)養(yang)基(ji)(不含(han)抗生(sheng)素)，37℃ 180 rpm 振蕩(dang)培(pei)養 10 min。

（註(zhu)意(yi)：大(da)於(yu) 3kb 的片(pian)段，振(zhen)蕩(dang)培(pei)養時(shi)間(jian)延長至 30-60 分鐘(zhong)，可(ke)以(yi)增加轉(zhuan)化子。或者(zhe)用(yong)簡化步驟(zhou)）

4）        取 200l 菌(jun)液塗板(含(han)氨芐青(qing)mei素 50-100ug/ml），培(pei)養過(guo)夜(ye)。（為(wei)得到較(jiao)多(duo)克(ke)隆，4000 rpm 離心(xin) 1 min，吸(xi)棄(qi)掉(diao)部分上(shang)清(qing)，保(bao)留 100-150ul，輕(qing)彈懸(xuan)浮(fu)菌(jun)體，取全(quan)部菌(jun)液塗板）

註意(yi)：如果(guo)使(shi)用(yong) 5ul 體系(xi)，各(ge)成(cheng)分按照(zhao)比(bi)例(li)減半(ban)，使(shi)用(yong)次數(shu)可(ke)以(yi)加倍(bei)。

4.         轉(zhuan)化子的篩(shai)選鑒(jian)定(ding)：

本(ben)制(zhi)品陽性(xing)率相當高，壹(yi)般(ban)情(qing)況下(xia)，可(ke)以(yi)達(da)到所(suo)見即(ji)所(suo)得，只要(yao)是長出來的菌(jun)落正常(chang)（不(bu)是汙(wu)染(ran)的(de)雜(za)菌(jun)，轉(zhuan)化子數(shu)量也(ye)不(bu)算太少(shao)），基(ji)本(ben)就(jiu)包含(han)插入。因(yin)此(ci)插入片段不(bu)超(chao)過(guo) 2-3kb 的(de)情(qing)況下(xia)可(ke)以(yi)不用(yong)鑒(jian)定(ding)直接(jie)挑(tiao) 1-2 個(ge)菌(jun)去測序(xu)。

1）   菌(jun)落 PCR 檢(jian)測：挑單菌(jun)落於 10ul 無菌(jun)水中(zhong)，混(hun)勻(yun)，取 1ul 置(zhi)於(yu) 25ul PCR 體系(xi),用(yong) PCR 引物(wu)或者(zhe)M13 通(tong)用(yong)引物去鑒(jian)定(ding)陽性(xing)克(ke)隆。

2）    用(yong)通(tong)用(yong) M13F（-20）/M13R（-26）引物測序(xu)來確(que)定(ding)是否含(han)有目的克隆。

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體圖譜：

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體(ti)序(xu)列(lie)：