可(ke)在室(shi)溫條件下，20分(fen)鐘完(wan)成TA克隆或Blunt克隆，陽(yang)性(xing)率接(jie)近(jin)100%，並(bing)且(qie)免冰(bing)浴(yu)、免熱(re)激、免(mian)藍(lan)白斑(ban)篩選，還可(ke)以(yi)連接長(chang)達10kb的(de)DNA片段(duan)。
TOPO-Blunt Lightning Cloning Kit

諾(nuo)博萊(lai)德(de) TOPO-Blunt Lightning Cloning Kit

TOPO-Blunt Lightning Cloning Kit（含酶切位(wei)點(dian)）

目(mu)錄號(hao)：42116

產(chan)品內(nei)容：

保存條件：

-20℃，存放(fang) 12 個(ge)月(yue)，不影響(xiang)使(shi)用效(xiao)果。

具(ju)體產(chan)品的(de)參(can)數(shu)以(yi)收(shou)到(dao)產(chan)品說明(ming)書(shu)的(de)參(can)數(shu)為準

產(chan)品簡(jian)介：

可(ke)在室(shi)溫條件下，20分(fen)鐘完(wan)成TA克隆或Blunt克隆，陽(yang)性(xing)率接(jie)近(jin)100%，並(bing)且(qie)免冰(bing)浴(yu)、免熱(re)激、免(mian)藍(lan)白斑(ban)篩選，還可(ke)以(yi)連接長(chang)達10kb的(de)DNA片段(duan)。

克(ke)隆步驟(zhou)（≤3kb 片段(duan)）：               

簡(jian)化步(bu)驟(zhou)（≤10kb 片段(duan)）-- 免(mian)復蘇(su)，免液體 LB

1、連接：室(shi)溫 5 分(fen)鐘；                      1、連接: 37℃連接 5 min。

2、轉(zhuan)化：室(shi)溫 5 分(fen)鐘；                      2、轉(zhuan)化：冰(bing)浴(yu) 5 min，42℃熱(re)激 1 min，冰(bing)上(shang) 2 min。

3、復(fu)蘇(su)：180rpm、37℃振蕩(dang)培(pei)養(yang) 10 分(fen)鐘；塗(tu)板。 3、取全部(bu)菌液塗(tu)板，37℃倒(dao)置(zhi)培(pei)養(yang)。

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1.         PCR 產(chan)物的(de)制(zhi)備(bei)：

a.       引(yin)物要求(qiu)：引(yin)物不(bu)能(neng)磷(lin)酸化(hua)。

b.     酶(mei)的(de)選(xuan)擇：根據需要選擇DNA 聚(ju)合(he)酶，該(gai)載(zai)體(ti)兼(jian)容PCR 產(chan)物的(de)A 末(mo)端和平末(mo)端。

c.        電(dian)泳(yong)檢測 PCR 產(chan)物的(de)量(liang)和質量(liang)：

①僅有目(mu)的(de)條(tiao)帶(dai)，可直(zhi)接(jie)進(jin)行連接反(fan)應，無(wu)需純化(hua)；

②如(ru)果有多(duo)條(tiao)帶(dai)，建議(yi)凝(ning)膠(jiao)回(hui)收 DNA 片段(duan)（DC011-100）;

③如(ru)果以(yi)質(zhi)粒(li)為模板的(de)擴(kuo)增(zeng)，則(ze)必須進行凝(ning)膠(jiao)回(hui)收，因(yin)為(wei)模板質粒(li)也會長出(chu)非目(mu)的(de)菌(jun)落。

2.         連接反(fan)應：

1）室(shi)溫（20℃-37℃）建立(li)連接體(ti)系(xi)（10ul 體(ti)系(xi)）：

不(bu)同(tong)大小(xiao)插入(ru)片段(duan)的(de)推薦用(yong)量(liang)：

加(jia)完(wan)試(shi)劑(ji)後(hou)，輕(qing)彈管底混勻（或(huo)輕(qing)輕(qing)吹打混勻），點(dian)甩離心(xin)收集所有液體在離心(xin)管底。

2) 室(shi)溫（20℃-37℃）連接 5 分(fen)鐘。連接產(chan)物可(ke)直(zhi)接(jie)轉(zhuan)化感(gan)受態(tai)細胞(bao)，或(huo)置(zhi)於冰上(shang)備(bei)用(yong)。

3.轉(zhuan)化、復(fu)蘇(su)、塗(tu)板：

1）100ul 感(gan)受態(tai)細胞(bao)，置(zhi)於室(shi)溫解凍(dong)（約(yue) 1 分(fen)鐘左右(you)），輕(qing)撣幾(ji)次(ci)將(jiang)細胞(bao)均(jun)勻懸(xuan)浮(fu)。

2）加(jia)入(ru) 10ul 連接液，輕(qing)輕(qing)混勻，室(shi)溫（20℃-37℃）放(fang)置(zhi) 5 分(fen)鐘。

3） 加(jia)入(ru) 500ul 平衡至(zhi)室(shi)溫的(de) LB 或(huo)者 SOC 培(pei)養(yang)基(ji)(不(bu)含抗生(sheng)素(su))，37℃ 180 rpm 振蕩(dang)培(pei)養(yang) 10 min。

（註意：大於 3kb 的(de)片段(duan)，振蕩(dang)培(pei)養(yang)時(shi)間(jian)延(yan)長(chang)至(zhi) 30-60 分(fen)鐘，可以(yi)增(zeng)加(jia)轉(zhuan)化子(zi)。或(huo)者用簡(jian)化步(bu)驟(zhou)）

4）取 200l 菌液塗(tu)板(含氨芐qing黴(mei)素(su) 50-100ug/ml），培養(yang)過(guo)夜(ye)。（為得到較(jiao)多(duo)克(ke)隆，4000 rpm 離心(xin) 1 min，吸(xi)棄(qi)掉(diao)部(bu)分(fen)上(shang)清(qing)，保留 100-150ul，輕(qing)彈懸(xuan)浮(fu)菌(jun)體(ti)，取全部(bu)菌液塗(tu)板）

註意：如(ru)果使(shi)用 5ul 體(ti)系(xi)，各成分(fen)按照比例減半，使(shi)用次(ci)數(shu)可以(yi)加(jia)倍(bei)。

4.         轉(zhuan)化子(zi)的(de)篩(shai)選鑒定(ding)：

本(ben)制(zhi)品陽性(xing)率相當(dang)高，壹般情(qing)況(kuang)下，可(ke)以(yi)達(da)到(dao)所(suo)見(jian)即(ji)所(suo)得，只要是長出(chu)來(lai)的(de)菌(jun)落正常（不(bu)是(shi)汙(wu)染(ran)的(de)雜(za)菌，轉(zhuan)化子(zi)數(shu)量(liang)也不算太少(shao)），基(ji)本(ben)就(jiu)包含插入(ru)。因(yin)此(ci)插入(ru)片段(duan)不超(chao)過 2-3kb 的(de)情(qing)況(kuang)下可(ke)以(yi)不(bu)用(yong)鑒定(ding)直(zhi)接挑(tiao) 1-2 個(ge)菌去(qu)測序(xu)。

1）    菌(jun)落 PCR 檢測：挑(tiao)單(dan)菌(jun)落(luo)於 10ul 無(wu)菌水(shui)中，混勻，取 1ul 置(zhi)於 25ul PCR 體(ti)系(xi),用(yong) PCR 引(yin)物或(huo)者M13 通用引(yin)物去(qu)鑒定(ding)陽性(xing)克隆(long)。

2）用(yong)通用 M13F（-20）/M13R（-26）引(yin)物測序(xu)來(lai)確定(ding)是否含有目(mu)的(de)克(ke)隆。

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體(ti)圖譜(pu)：

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體(ti)序(xu)列(lie)：