可(ke)在(zai)室(shi)溫(wen)條(tiao)件(jian)下，20分鐘(zhong)完(wan)成(cheng)TA克隆或(huo)Blunt克隆，陽(yang)性率(lv)接(jie)近100%，並(bing)且免冰(bing)浴(yu)、免熱(re)激、免藍(lan)白(bai)斑篩選(xuan)，還(hai)可(ke)以(yi)連(lian)接(jie)長(chang)達10kb的(de)DNA片段(duan)。
TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit

諾(nuo)博(bo)萊德 TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit

TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit 

目錄號：42117

產(chan)品(pin)內(nei)容：

保存(cun)條(tiao)件(jian)：

-20℃，存(cun)放(fang) 12 個月(yue)，不影響使(shi)用效(xiao)果。

具體(ti)產(chan)品(pin)的(de)參(can)數(shu)以(yi)收到(dao)產(chan)品(pin)說(shuo)明書(shu)的(de)參(can)數(shu)為(wei)準

產(chan)品(pin)簡(jian)介：

可(ke)在(zai)室(shi)溫(wen)條(tiao)件(jian)下，20分鐘(zhong)完(wan)成(cheng)TA克隆或(huo)Blunt克隆，陽(yang)性率(lv)接(jie)近100%，並(bing)且免冰(bing)浴(yu)、免熱(re)激、免藍(lan)白(bai)斑篩選(xuan)，還(hai)可(ke)以(yi)連(lian)接(jie)長(chang)達10kb的(de)DNA片段(duan)。

克隆步(bu)驟（≤3kb 片段(duan)）：               

簡化步驟(zhou)（≤10kb 片段(duan)）-- 免復(fu)蘇(su)，免液體(ti) LB

1、連(lian)接(jie)：室溫(wen) 5 分鐘(zhong)；                      1、連(lian)接(jie): 37℃連(lian)接(jie) 5 min。

2、轉(zhuan)化：室溫(wen) 5 分鐘(zhong)；                      2、轉(zhuan)化：冰(bing)浴(yu) 5 min，42℃熱激 1 min，冰(bing)上 2 min。

3、復(fu)蘇(su)：180rpm、37℃振(zhen)蕩培(pei)養 10 分鐘(zhong)；塗板。 3、取(qu)全部(bu)菌(jun)液塗板，37℃倒置(zhi)培養。

操作步(bu)驟(zhou)：

1.         PCR 產(chan)物的(de)制備(bei)：

a.       引物要(yao)求(qiu)：引物不能磷酸(suan)化。

b.     酶的選(xuan)擇(ze)：根據需要選(xuan)擇(ze)DNA 聚合酶，該載(zai)體(ti)兼容(rong)PCR 產(chan)物的(de)A 末端和平(ping)末(mo)端。

c.        電泳檢測 PCR 產(chan)物的(de)量(liang)和質(zhi)量：

①僅有(you)目(mu)的(de)條(tiao)帶(dai)，可(ke)直(zhi)接(jie)進(jin)行連(lian)接(jie)反(fan)應，無需(xu)純(chun)化；

②如果有(you)多(duo)條帶(dai)，建(jian)議(yi)凝(ning)膠(jiao)回收 DNA 片段(duan)（DC011-100）;

③如果以(yi)質粒(li)為(wei)模板的擴增，則必須(xu)進(jin)行凝膠(jiao)回收，因為(wei)模板質粒(li)也會長(chang)出(chu)非(fei)目(mu)的(de)菌(jun)落(luo)。

2.         連(lian)接(jie)反(fan)應：

1）室溫（20℃-37℃）建(jian)立(li)連(lian)接(jie)體(ti)系(xi)（10ul 體(ti)系(xi)）：

不同(tong)大小(xiao)插(cha)入片段(duan)的(de)推(tui)薦用量：

加(jia)完試劑後(hou)，輕(qing)彈(dan)管底混(hun)勻（或(huo)輕(qing)輕(qing)吹(chui)打(da)混(hun)勻），點甩(shuai)離心收集所有(you)液體(ti)在離心管底。

2) 室溫（20℃-37℃）連(lian)接(jie) 5 分鐘(zhong)。連(lian)接(jie)產(chan)物可(ke)直(zhi)接(jie)轉(zhuan)化感受(shou)態(tai)細(xi)胞，或(huo)置於(yu)冰(bing)上備(bei)用。

3.         轉(zhuan)化、復(fu)蘇(su)、塗板：

1）100ul 感受態(tai)細(xi)胞，置於(yu)室溫(wen)解(jie)凍（約(yue) 1 分鐘(zhong)左(zuo)右(you)），輕(qing)撣(dan)幾次(ci)將細(xi)胞均(jun)勻懸浮(fu)。

2）     加(jia)入 10ul 連(lian)接(jie)液，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻，室(shi)溫(wen)（20℃-37℃）放置 5 分鐘(zhong)。

3）      加(jia)入 500ul 平衡至室溫的(de) LB 或(huo)者(zhe) SOC 培養基(ji)(不含(han)抗生素(su))，37℃ 180 rpm 振(zhen)蕩培(pei)養 10 min。

（註(zhu)意：大於(yu) 3kb 的片段(duan)，振(zhen)蕩培(pei)養時(shi)間延長(chang)至 30-60 分鐘(zhong)，可(ke)以(yi)增加(jia)轉(zhuan)化子。或(huo)者(zhe)用簡化步驟(zhou)）

4）        取(qu) 200l 菌(jun)液塗板(含(han)氨(an)芐qing黴(mei)素 50-100ug/ml），培養過(guo)夜。（為(wei)得到(dao)較(jiao)多(duo)克隆，4000 rpm 離心 1 min，吸棄掉(diao)部分上清(qing)，保留(liu) 100-150ul，輕(qing)彈(dan)懸浮(fu)菌(jun)體(ti)，取(qu)全部(bu)菌(jun)液塗板）

註(zhu)意：如(ru)果使(shi)用 5ul 體(ti)系(xi)，各(ge)成(cheng)分按照比例減(jian)半(ban)，使(shi)用次(ci)數可(ke)以(yi)加(jia)倍(bei)。

4.         轉(zhuan)化子的(de)篩選(xuan)鑒(jian)定：

本(ben)制品(pin)陽(yang)性率(lv)相(xiang)當高(gao)，壹(yi)般情況(kuang)下，可(ke)以(yi)達到(dao)所(suo)見(jian)即(ji)所(suo)得，只(zhi)要(yao)是(shi)長(chang)出(chu)來(lai)的(de)菌(jun)落(luo)正(zheng)常（不是(shi)汙染的(de)雜菌(jun)，轉(zhuan)化子數(shu)量也(ye)不算太少(shao)），基(ji)本(ben)就包(bao)含(han)插(cha)入。因此插(cha)入片段(duan)不超過 2-3kb 的情況(kuang)下可(ke)以(yi)不用鑒定(ding)直(zhi)接(jie)挑 1-2 個菌(jun)去(qu)測序。

1）     菌(jun)落(luo) PCR 檢測：挑單菌(jun)落(luo)於(yu) 10ul 無菌(jun)水(shui)中，混(hun)勻，取(qu) 1ul 置於(yu) 25ul PCR 體(ti)系(xi),用 PCR 引物或(huo)者(zhe)M13 通(tong)用引物去(qu)鑒(jian)定陽性克隆。

2）用通(tong)用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測序來(lai)確(que)定(ding)是(shi)否含(han)有(you)目(mu)的(de)克隆。

pTOPO-TA/Blunt 載體(ti)序列：