可(ke)在(zai)室(shi)溫條件(jian)下，20分(fen)鐘(zhong)完成TA克隆或Blunt克隆，陽性率接近(jin)100%，並(bing)且免冰浴(yu)、免熱激、免藍(lan)白(bai)斑(ban)篩(shai)選，還可(ke)以(yi)連(lian)接長達(da)10kb的DNA片段(duan)。
TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit

諾博萊(lai)德(de) TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit

TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit（含酶切(qie)位(wei)點）

目錄(lu)號(hao)：42211

產品內容(rong)：

保存條件(jian)：

-20℃，存放(fang) 12 個月(yue)，不影(ying)響(xiang)使(shi)用效(xiao)果(guo)。

具體(ti)產品的(de)參(can)數(shu)以收(shou)到產(chan)品說明(ming)書的(de)參(can)數(shu)為準

產品簡介(jie)：

可(ke)在(zai)室(shi)溫條件(jian)下，20分(fen)鐘(zhong)完成TA克隆或Blunt克隆，陽性率接近(jin)100%，並(bing)且免冰浴(yu)、免熱激、免藍(lan)白(bai)斑(ban)篩(shai)選，還可(ke)以(yi)連(lian)接長達(da)10kb的DNA片段(duan)。

克隆步驟(zhou)（≤3kb 片段(duan)）：               

簡化(hua)步(bu)驟(zhou)（≤10kb 片段(duan)）-- 免復蘇(su)，免液體(ti) LB

1、連接：室(shi)溫 5 分(fen)鐘(zhong)；                      1、連接: 37℃連接 5 min。

2、轉化：室(shi)溫 5 分(fen)鐘(zhong)；                      2、轉化：冰浴(yu) 5 min，42℃熱激 1 min，冰上 2 min。

3、復蘇(su)：180rpm、37℃振蕩培(pei)養(yang) 10 分(fen)鐘(zhong)；塗板(ban)。 3、取全(quan)部菌液(ye)塗板(ban)，37℃倒(dao)置培(pei)養。

操作步驟(zhou)：

1.         PCR 產物的(de)制(zhi)備(bei)：

a.       引物要(yao)求：引物不能(neng)磷酸(suan)化(hua)。

b.     酶的選(xuan)擇(ze)：根(gen)據(ju)需(xu)要(yao)選擇DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)，該載體(ti)兼(jian)容(rong)PCR 產物的(de)A 末(mo)端(duan)和(he)平(ping)末(mo)端(duan)。

c.        電泳檢測 PCR 產物的(de)量(liang)和(he)質(zhi)量(liang)：

①僅有(you)目的(de)條帶，可(ke)直(zhi)接進(jin)行連(lian)接反應(ying)，無需(xu)純(chun)化(hua)；

②如果有(you)多(duo)條帶，建(jian)議(yi)凝(ning)膠回收(shou) DNA 片段(duan)（DC011-100）;

③如果以(yi)質(zhi)粒為模(mo)板(ban)的擴增，則(ze)必須進(jin)行凝(ning)膠回收(shou)，因為模(mo)板(ban)質粒也會長出非(fei)目的(de)菌(jun)落(luo)。

2.         連接反應(ying)：

1） 室(shi)溫（20℃-37℃）建(jian)立(li)連接體(ti)系(xi)（10ul 體(ti)系(xi)）：

不同大小插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)的推薦(jian)用(yong)量(liang)：

加完試劑後(hou)，輕彈管底混(hun)勻（或輕輕吹(chui)打混(hun)勻），點甩(shuai)離(li)心(xin)收(shou)集(ji)所(suo)有(you)液(ye)體(ti)在(zai)離(li)心(xin)管(guan)底(di)。

2) 室(shi)溫（20℃-37℃）連接 5 分(fen)鐘(zhong)。連接產物(wu)可(ke)直(zhi)接轉化感(gan)受態細胞，或置於(yu)冰上備(bei)用(yong)。

3.         轉化、復蘇(su)、塗板(ban)：

1）100ul 感(gan)受態細胞，置於室(shi)溫解(jie)凍（約 1 分(fen)鐘(zhong)左右(you)），輕撣幾次將細(xi)胞(bao)均(jun)勻懸浮(fu)。

2）   加入 10ul 連接液，輕輕混勻，室(shi)溫（20℃-37℃）放(fang)置(zhi) 5 分(fen)鐘(zhong)。

3）       加入 500ul 平(ping)衡(heng)至室(shi)溫的(de) LB 或者 SOC 培養基(ji)(不(bu)含抗生(sheng)素(su))，37℃ 180 rpm 振蕩培(pei)養(yang) 10 min。

（註意：大於(yu) 3kb 的片段(duan)，振蕩培(pei)養(yang)時間(jian)延(yan)長至 30-60 分(fen)鐘(zhong)，可(ke)以(yi)增(zeng)加轉化子。或者用簡化(hua)步(bu)驟(zhou)）

4）        取 200l 菌液塗板(ban)(含氨芐qing黴素(su) 50-100ug/ml），培養過(guo)夜(ye)。（為得到(dao)較(jiao)多(duo)克隆，4000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，吸棄掉(diao)部分(fen)上(shang)清，保留(liu) 100-150ul，輕彈懸浮(fu)菌(jun)體(ti)，取全(quan)部菌液(ye)塗板(ban)）

註意：如(ru)果使(shi)用 5ul 體(ti)系(xi)，各成分(fen)按(an)照比例(li)減(jian)半(ban)，使(shi)用次(ci)數(shu)可(ke)以(yi)加倍(bei)。

4.         轉化子的篩(shai)選(xuan)鑒(jian)定(ding)：

本(ben)制(zhi)品(pin)陽性率相(xiang)當(dang)高(gao)，壹(yi)般情況下，可(ke)以(yi)達(da)到(dao)所(suo)見(jian)即所(suo)得(de)，只要(yao)是長出來的(de)菌(jun)落正(zheng)常(chang)（不(bu)是(shi)汙染(ran)的(de)雜(za)菌(jun)，轉化子數(shu)量(liang)也不算太少(shao)），基本(ben)就(jiu)包(bao)含插(cha)入(ru)。因此(ci)插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)不超過(guo) 2-3kb 的情況(kuang)下(xia)可(ke)以(yi)不(bu)用(yong)鑒(jian)定(ding)直(zhi)接挑(tiao) 1-2 個(ge)菌(jun)去測序(xu)。

1）  菌落 PCR 檢測：挑(tiao)單菌落於 10ul 無菌水中，混(hun)勻，取 1ul 置於 25ul PCR 體(ti)系(xi),用 PCR 引物或者M13 通用(yong)引物去鑒(jian)定(ding)陽性克隆。

2）用通用(yong) M13F（-20）/M13R（-26）引物測序(xu)來確(que)定(ding)是否含有(you)目的(de)克(ke)隆。

pTOPO-TA/Blunt 載體(ti)圖譜：

pTOPO-TA/Blunt  載體(ti)通用測序(xu)引物序(xu)列：

M13F（-20）: TGTAAAACGACGGCCAGT M13R（-26）: CAGGAAACAGCTATGACC

註意：不(bu)要(yao)用錯引物，M13 通用引物有(you)多(duo)種(zhong)。

pTOPO-TA/Blunt 載體(ti)序(xu)列(lie)：