可(ke)在(zai)室溫條件(jian)下(xia)，20分(fen)鐘完(wan)成(cheng)TA克(ke)隆或(huo)Blunt克(ke)隆，陽(yang)性(xing)率(lv)接(jie)近(jin)100%，並(bing)且(qie)免冰(bing)浴、免熱(re)激、免藍(lan)白(bai)斑(ban)篩選(xuan)，還(hai)可(ke)以連接(jie)長(chang)達10kb的DNA片段。
TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit

諾博萊(lai)德 TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit

TOPO-TA Blunt Simple Lightning Cloning Kit

目錄(lu)號(hao)：42212

產(chan)品內容：

保存條件(jian)：

-20℃，存放(fang) 12 個(ge)月(yue)，不影響(xiang)使用效果(guo)。

產(chan)品簡介：

可(ke)在(zai)室溫條件(jian)下(xia)，20分(fen)鐘完(wan)成(cheng)TA克(ke)隆或(huo)Blunt克(ke)隆，陽(yang)性(xing)率(lv)接(jie)近(jin)100%，並(bing)且(qie)免冰(bing)浴、免熱(re)激、免藍(lan)白(bai)斑(ban)篩選(xuan)，還(hai)可(ke)以連接(jie)長(chang)達10kb的DNA片段。

克(ke)隆步(bu)驟(zhou)（≤3kb 片段）：                

 簡(jian)化(hua)步(bu)驟(zhou)（≤10kb 片段） 免復(fu)蘇，免液(ye)體(ti) LB

1、連(lian)接(jie)：室(shi)溫5鐘；                       

 1、連(lian)接(jie): 37℃連(lian)接(jie) 5 min。

2、轉化：室(shi)溫 5 鐘；                        

2、轉化：冰(bing)浴 5 min，42℃熱(re)激 1 min，冰(bing)上(shang) 2 min。

3、復(fu)蘇：180rpm、37℃振蕩(dang)培養(yang) 10 分(fen)鐘；塗(tu)板。 

3、取全(quan)部菌(jun)液(ye)塗(tu)板(ban)，37℃倒(dao)置(zhi)培(pei)養(yang)。

操作步(bu)驟(zhou)：

1.         PCR 產(chan)物的(de)制(zhi)備(bei)：

a.       引物要(yao)求(qiu)：引物不能(neng)磷酸(suan)化(hua)。

b.     酶的選(xuan)擇(ze)：根據(ju)需(xu)要(yao)選(xuan)擇(ze)DNA 聚(ju)合酶，該(gai)載(zai)體(ti)兼容PCR 產(chan)物的(de)A 末(mo)端和(he)平(ping)末端。

c.        電泳檢(jian)測(ce) PCR 產(chan)物的(de)量(liang)和(he)質量(liang)：

①僅(jin)有(you)目的(de)條帶，可(ke)直(zhi)接(jie)進(jin)行連接(jie)反(fan)應(ying)，無需純化；

②如果(guo)有(you)多(duo)條帶(dai)，建議凝(ning)膠(jiao)回收(shou) DNA 片段（DC011-100）;

③如果(guo)以質粒(li)為(wei)模(mo)板的(de)擴(kuo)增，則(ze)必須(xu)進(jin)行凝(ning)膠(jiao)回收(shou)，因(yin)為(wei)模(mo)板質粒(li)也(ye)會長(chang)出非目的(de)菌(jun)落。

2.         連(lian)接(jie)反(fan)應(ying)：

1） 室(shi)溫（20℃-37℃）建立連接(jie)體(ti)系（10ul 體(ti)系）：

不同(tong)大(da)小(xiao)插入(ru)片段的推薦(jian)用量(liang)：

加完試(shi)劑後(hou)，輕(qing)彈(dan)管底混(hun)勻(yun)（或(huo)輕(qing)輕吹打混(hun)勻(yun)），點(dian)甩離(li)心(xin)收集(ji)所(suo)有(you)液(ye)體(ti)在(zai)離(li)心(xin)管底。

2) 室(shi)溫（20℃-37℃）連(lian)接(jie) 5 分(fen)鐘。連(lian)接(jie)產(chan)物可(ke)直(zhi)接(jie)轉化感(gan)受(shou)態細(xi)胞，或(huo)置(zhi)於(yu)冰上(shang)備(bei)用。

3.         轉化、復(fu)蘇、塗(tu)板：

1）100ul 感(gan)受(shou)態細(xi)胞，置(zhi)於(yu)室溫解凍(dong)（約 1 分(fen)鐘左(zuo)右），輕(qing)撣(dan)幾次(ci)將細胞均勻(yun)懸(xuan)浮(fu)。

2）     加入(ru) 10ul 連(lian)接(jie)液(ye)，輕輕(qing)混(hun)勻(yun)，室(shi)溫（20℃-37℃）放(fang)置(zhi) 5 分(fen)鐘。

3）      加入(ru) 500ul 平(ping)衡(heng)至(zhi)室(shi)溫的 LB 或(huo)者(zhe) SOC 培(pei)養(yang)基(ji)(不含(han)抗(kang)生(sheng)素)，37℃ 180 rpm 振蕩(dang)培養(yang) 10 min。

（註(zhu)意：大(da)於(yu) 3kb 的(de)片段，振蕩(dang)培養(yang)時(shi)間延長(chang)至 30-60 分(fen)鐘，可(ke)以增加轉化子。或(huo)者(zhe)用簡化步(bu)驟(zhou)）

4）        取 200l 菌(jun)液(ye)塗(tu)板(ban)(含(han)氨(an)芐qing黴(mei)素(su) 50-100ug/ml），培(pei)養(yang)過(guo)夜。（為(wei)得(de)到(dao)較多(duo)克(ke)隆，4000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，吸棄掉部分(fen)上(shang)清(qing)，保留(liu) 100-150ul，輕彈懸浮(fu)菌(jun)體(ti)，取全(quan)部菌(jun)液(ye)塗(tu)板(ban)）

註(zhu)意：如果(guo)使用 5ul 體(ti)系，各(ge)成(cheng)分(fen)按照(zhao)比例減(jian)半，使用次(ci)數(shu)可(ke)以加倍。

4.         轉化子的(de)篩選(xuan)鑒(jian)定(ding)：

本制(zhi)品陽性(xing)率(lv)相當高(gao)，壹(yi)般情況(kuang)下，可(ke)以達到所(suo)見即所(suo)得(de)，只要(yao)是(shi)長(chang)出來(lai)的菌(jun)落正(zheng)常(chang)（不是(shi)汙染(ran)的(de)雜(za)菌(jun)，轉化子數(shu)量(liang)也(ye)不算(suan)太少），基(ji)本就(jiu)包(bao)含(han)插(cha)入(ru)。因(yin)此插入(ru)片段不超過(guo) 2-3kb 的(de)情(qing)況(kuang)下可(ke)以不用鑒定直(zhi)接(jie)挑(tiao) 1-2 個(ge)菌(jun)去(qu)測(ce)序。

1）  菌(jun)落 PCR 檢(jian)測(ce)：挑單菌(jun)落於(yu) 10ul 無菌(jun)水(shui)中，混(hun)勻(yun)，取 1ul 置(zhi)於(yu) 25ul PCR 體(ti)系,用 PCR 引物或(huo)者(zhe)M13 通用引物去(qu)鑒定陽性(xing)克(ke)隆。

2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測(ce)序來(lai)確定是(shi)否(fou)含(han)有(you)目的(de)克(ke)隆。

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體(ti)圖(tu)譜(pu)：

pTOPO-TA/Blunt 載(zai)體(ti)序(xu)列(lie)：

TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit