壹步法無(wu)縫(feng)克隆試(shi)劑盒(he)不(bu)依賴於T4連接(jie)酶，不(bu)受載體(ti)和目的片段的酶切(qie)位(wei)點(dian)限(xian)制，而直接用(yong)重(zhong)疊(die)片(pian)段重組的(de)方(fang)法，采用(yong)特殊(shu)的酶組合(he)可以將(jiang)任意(yi)方(fang)法線性(xing)化後的載體和與其(qi)兩端(duan)具有(you)16-25bp重疊(die)區域的PCR片段定向重(zhong)組連接(jie)
One Step Seamless Cloning Kit無縫克隆

諾(nuo)博萊德 One Step Seamless Cloning Kit無(wu)縫克隆

One Step Seamless Cloning Kit (單(dan)片段)

目錄(lu)號(hao)：42111

包 裝(zhuang) 量：

產(chan)品(pin)儲(chu)存：-20°C保存，避(bi)免(mian)多(duo)次反(fan)復(fu)凍(dong)融

具體(ti)產(chan)品(pin)的(de)參數(shu)以(yi)收到(dao)產(chan)品(pin)說(shuo)明書(shu)的參數(shu)為準(zhun)

制(zhi)品(pin)說(shuo)明：壹(yi)步法無(wu)縫(feng)克隆試(shi)劑盒(he)不(bu)依賴於T4連接(jie)酶，不(bu)受載體(ti)和目的片段的酶切(qie)位(wei)點(dian)限(xian)制，而直接用(yong)重(zhong)疊(die)片(pian)段重組的(de)方(fang)法，采用(yong)特殊(shu)的酶組合(he)可以將(jiang)任意(yi)方(fang)法線性(xing)化後的載體和與其(qi)兩端(duan)具有(you)16-25bp重疊(die)區域的PCR片段定向重(zhong)組連接(jie)，可以30分鐘(zhong)內實(shi)現A末端(duan)或(huo)者平末端(duan)PCR產(chan)物片(pian)段高效定向無(wu)縫(feng)克隆至(zhi)載(zai)體的(de)任意(yi)位(wei)點(dian)。

產(chan)品(pin)特點(dian)：

1.  30分(fen)鐘(zhong)可以(yi)將(jiang)壹(yi)個50bp-15kb PCR擴增(zeng)片段（平/A末端(duan)）克(ke)隆插入任意(yi)載(zai)體(ti)的(de)任意(yi)位(wei)置(zhi)。

2.不(bu)受載體(ti)和插入片段酶切(qie)位(wei)點(dian)的(de)可用(yong)性(xing)和平端(duan)/粘(zhan)性(xing)末端(duan)的(de)限制(zhi)，可以在(zai)任意(yi)位(wei)點(dian)進(jin)行(xing)克(ke)隆。

3.  無(wu)縫克隆，插入點不(bu)會引(yin)入不(bu)需要的堿(jian)基(ji)序列(lie)。

4.  不(bu)依賴於連接(jie)酶及(ji)磷(lin)酸(suan)酶，高(gao)效，準(zhun)確，克隆陽性(xing)率(lv)可達(da)95%以上(shang)。

壹(yi)步法無(wu)縫(feng)克隆試(shi)劑盒(he)原理(li)示(shi)意(yi)圖(tu)：

線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)和插入DNA片段的制(zhi)備(bei)：

A：線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)的制(zhi)備(bei)

(1). 酶切(qie)來(lai)源：酶切(qie)所(suo)得線性(xing)載(zai)體，平末端(duan)或(huo)者粘(zhan)端(duan)、單(dan)酶切(qie)或(huo)者(zhe)雙(shuang)酶切(qie)均可，酶切(qie)後膠回收。

註(zhu)： 壹步法無(wu)縫(feng)克隆反(fan)應(ying)體(ti)系內無雙(shuang)鏈(lian)DNA連接(jie)酶，不(bu)會發(fa)生(sheng)載體(ti)自(zi)連反(fan)應(ying)。因(yin)此，即(ji)使是以(yi)單(dan)酶切(qie)方(fang)式(shi)制(zhi)備(bei)的(de)線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)也無(wu)需(xu)進行(xing)末端(duan)脫(tuo)磷酸(suan)處(chu)理。重組產(chan)物轉(zhuan)化後出現的(de)假陽性(xing)克(ke)隆 (無(wu)插入片段) 是由(you)酶切(qie)不(bu)完quan未線(xian)性(xing)化環狀(zhuang)載體(ti)轉化而形(xing)成(cheng)的(de)。我(wo)們(men)推(tui)薦酶切(qie)後膠回收可(ke)以(yi)把(ba)這種未線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)比(bi)例(li)降(jiang)低到(dao)最(zui)di程度。

(2). 反(fan)向PCR來(lai)源：建(jian)議(yi)使用(yong)高(gao)保真(zhen)DNA聚合(he)酶（貨(huo)號：P517-05或者(zhe)P812-05）制備(bei)，如果擴增(zeng)條帶單壹(yi)可(ke)以(yi)通(tong)過PCR產(chan)物純(chun)化（貨(huo)號：DC012-50）獲得(de)載體(ti)，否則(ze)通(tong)過膠(jiao)回(hui)收(shou)（貨(huo)號：DC011-50)獲得(de)載體(ti)。

註(zhu)：反向PCR的(de)質粒(li)模(mo)板也是(shi)非(fei)線性(xing)化載(zai)體(ti)，也可(ke)能(neng)導(dao)致假(jia)陽性(xing)克(ke)隆（無(wu)插入片段），因(yin)此PCR來(lai)源線(xian)性(xing)載(zai)體（PCR產(chan)物）純(chun)化前(qian)用(yong)Dpn I內(nei)切(qie)酶消(xiao)化質粒(li)模(mo)板，可(ke)以降低背景(jing)，提高(gao)陽性(xing)率(lv)。但是(shi)壹般(ban)情況(kuang)下(xia)，經(jing)過膠(jiao)回(hui)收(shou)已經(jing)足(zu)以(yi)把(ba)這種未線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)比(bi)例(li)降(jiang)低到(dao)最(zui)di，因(yin)此反向PCR來(lai)源的(de)線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)我們(men)也推(tui)薦膠回(hui)收。

B：插入DNA片段的制(zhi)備(bei)

(1). 壹(yi)步法無(wu)縫(feng)克隆引(yin)物設(she)計總(zong)的(de)原則(ze)是(shi)：通(tong)過在(zai)引(yin)物5’ 端(duan)引(yin)入線性(xing)化克(ke)隆載(zai)體末端(duan)同(tong)源序(xu)列(lie)，使得(de)插入片段擴增(zeng)產(chan)物5’和3’最(zui)末端(duan)分(fen)別帶(dai)有(you)和線性(xing)化克(ke)隆載(zai)體兩(liang)末端(duan)對應(ying)的(de)完quan壹致的(de)序(xu)列(lie) (16 bp～20 bp)。

(2). 插入片段引(yin)物設(she)計：克隆引(yin)物包括(kuo)插入片段特異(yi)性(xing)引(yin)物序(xu)列(lie)和重疊(die)序列(lie)。

克(ke)隆正(zheng)向引(yin)物(5’-3’)：線(xian)性(xing)載(zai)體正(zheng)向16-25 nt重(zhong)疊(die)區序(xu)列(lie)(3’末端(duan)算起(qi))+插入片段正(zheng)向特異(yi)引(yin)物序(xu)列(lie)（18-25 nt）

克(ke)隆反(fan)向引(yin)物(5’-3’)：線(xian)性(xing)載(zai)體反向16-25 nt重(zhong)疊(die)區序(xu)列(lie)(3’末端(duan)算起(qi))+插入片段反向特異(yi)引(yin)物序(xu)列(lie)（18-25 nt）

註(zhu)意(yi)：重(zhong)疊(die)區(qu)的(de)堿(jian)基(ji)數(shu)至(zhi)少(shao)16 bp，並且(qie)多(duo)段重疊(die)區(qu)域之(zhi)間(jian)的Tm值需(xu)保持壹致(zhi)且(qie)﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)，否則(ze)可(ke)延長(chang)堿(jian)基(ji)數(shu)目直到(dao)符(fu)合(he)要求。

按(an)照(zhao)線(xian)性(xing)載(zai)體末端(duan)的(de)結構（5’突出，3’突(tu)出，平末端(duan)），引(yin)物設(she)計也分(fen)3種情(qing)況(kuang)，示(shi)意(yi)如下(xia)：

線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)的兩(liang)端(duan)因(yin)線性(xing)方(fang)式(shi)（如單酶切(qie)、雙(shuang)酶切(qie)、反(fan)向PCR）不(bu)同，可以(yi)是(shi)以(yi)上(shang)三種末端(duan)結構的兩(liang)兩任意(yi)組合(he)，插入片段特異(yi)性(xing)引(yin)物設(she)計的原則(ze)遵(zun)循壹般(ban)引(yin)物設(she)計的原則(ze)即(ji)可。

計(ji)算擴增(zeng)引(yin)物退(tui)火(huo)溫度時，只(zhi)需計(ji)算基因(yin)特異(yi)性(xing)擴(kuo)增序列(lie)的Tm值，載(zai)體(ti)末端(duan)同(tong)源序(xu)列(lie)不(bu)應(ying)參與計(ji)算。

(3). 酶的(de)選擇：建(jian)議(yi)使用(yong)高(gao)保真(zhen)DNA聚合(he)酶或(huo)者(zhe)PCR Mix（貨(huo)號：P517-05或者(zhe)P814-05）。

(4). 反(fan)應(ying)條(tiao)件：壹般按(an)照(zhao)具體(ti)使(shi)用(yong)的(de)聚(ju)合(he)酶說(shuo)明(ming)書(shu)進行(xing)即(ji)可。

(5). 純(chun)化插入片段

l   可(ke)選：如果片段來(lai)源於質粒(li)模(mo)板，且(qie)該(gai)質粒(li)與(yu)重組載(zai)體具有(you)相同(tong)抗性(xing)，純(chun)化前(qian)用(yong)Dpn I內(nei)切(qie)酶消(xiao)化質粒(li)模(mo)板， 可(ke)降低背景(jing)，提高(gao)陽性(xing)率(lv)。

l   如果片段單壹(yi)，則(ze)建(jian)議(yi)用(yong)PCR產(chan)物純(chun)化試(shi)劑(ji)盒(he)（貨(huo)號：DC012-100）純(chun)化片(pian)段。

l   如果有(you)非特異(yi)擴(kuo)增(zeng)，則(ze)建(jian)議(yi)用(yong)膠(jiao)回(hui)收(shou)試劑盒(he)（貨(huo)號：DC011-100)回收(shou)片段。

l   使(shi)用(yong)該(gai)方(fang)法克隆，用(yong)來(lai)線(xian)性(xing)化載(zai)體(ti)的酶切(qie)位(wei)點(dian)在(zai)拼(pin)接的(de)時候(hou)會缺(que)失(shi)，如果對酶切(qie)位(wei)點(dian)有(you)嚴格要求的，建議(yi)註意(yi)酶切(qie)位(wei)點(dian)的(de)選擇，必(bi)要時可(ke)在(zai)正(zheng)反(fan)向克(ke)隆引(yin)物的(de)重疊區(qu)序列(lie)和特異(yi)基(ji)因(yin)序列(lie)之(zhi)間(jian)增加缺(que)失(shi)掉(diao)的堿(jian)基(ji)來(lai)恢復(fu)原有(you)酶切(qie)位(wei)點(dian)（見(jian)後面舉(ju)例(li)說(shuo)明(ming)）。

l   如果重組質粒(li)用(yong)於蛋白(bai)表達，則(ze)在(zai)引(yin)物設(she)計時註(zhu)意(yi)讀(du)碼框(kuang)，蛋白(bai)表(biao)達及(ji)純(chun)化所(suo)需序列(lie)（如啟動(dong)子，RBS序(xu)列(lie)，起(qi)始密碼子，終(zhong)止(zhi)密碼子，蛋(dan)白(bai)標簽(qian)等）不(bu)被(bei)破壞。

正(zheng)向引(yin)物設(she)計舉(ju)例(li)說(shuo)明(ming)（EcoR I 酶切(qie)開）：

如上圖(tu)，載(zai)體由Ecor I 酶切(qie)開，形(xing)成(cheng)5’突(tu)出末端(duan)：

根據上述設計(ji)原則(ze)，從(cong)3’端(duan)開始計算，往回(hui)算16bp-25bp（本(ben)舉(ju)例(li)采(cai)用(yong)了(le)20 bp末端(duan)重(zhong)疊相(xiang)同(tong)序列(lie)），加到(dao)目的片段特異(yi)引(yin)物序(xu)列(lie)前(qian)面(mian)即(ji)可。確保重(zhong)疊(die)區域(yu)的(de)Tm值保持壹致(zhi)且(qie)﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

正(zheng)向引(yin)物具體(ti)如下(xia)：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

註(zhu)意(yi)：以(yi)上(shang)引(yin)物設(she)計完成(cheng)克(ke)隆連接(jie)後，EcoR I 酶切(qie)位(wei)點(dian)將(jiang)會消(xiao)失(shi)（不(bu)保留(liu)酶切(qie)位(wei)點(dian)）。

如果需要保留(liu) EcoR I 酶切(qie)位(wei)點(dian)，需(xu)要在(zai)載體(ti)末端(duan)20 bp重(zhong)疊序(xu)列(lie)和目的片段特異(yi)引(yin)物序(xu)列(lie)之(zhi)間(jian)補齊缺(que)失(shi)的EcoR I 識(shi)別位(wei)點(dian)序(xu)列(lie)aattc，完成(cheng)克(ke)隆連接(jie)後，EcoR I 酶切(qie)位(wei)點(dian)依(yi)然存在(zai)（保留(liu)酶切(qie)位(wei)點(dian)）。

具體(ti)如下(xia)：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

反(fan)向引(yin)物設(she)計舉(ju)例(li)說(shuo)明(ming)（Hind III 酶切(qie)開）：                           

如上圖(tu)，載(zai)體由Hind III 酶切(qie)開，形(xing)成(cheng)5’突(tu)出末端(duan)：

根據上述設計(ji)原則(ze)，從(cong)3’端(duan)開始計算，往回(hui)算16bp-25bp（本(ben)舉(ju)例(li)采(cai)用(yong)了(le)20 bp末端(duan)重(zhong)疊相(xiang)同(tong)序列(lie)），加到(dao)目的片段特異(yi)引(yin)物序(xu)列(lie)前(qian)面(mian)即(ji)可。確保重(zhong)疊(die)區域(yu)的(de)Tm值保持壹致(zhi)且(qie)﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

反(fan)向引(yin)物具體(ti)如下(xia)：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

註(zhu)意(yi)：以(yi)上(shang)引(yin)物設(she)計完成(cheng)克(ke)隆連接(jie)後，Hind III 切位點將(jiang)會(hui)消(xiao)失(shi)（不(bu)保留(liu)酶切(qie)位(wei)點(dian)）。

如果需要保留(liu) Hind III 酶切(qie)位(wei)點(dian)，需(xu)要在(zai)載體(ti)末端(duan)20 bp重(zhong)疊序(xu)列(lie)和目的片段特異(yi)引(yin)物序(xu)列(lie)之(zhi)間(jian)補齊缺(que)失(shi)的Hind III 識(shi)別位(wei)點(dian)序(xu)列(lie)agctt ，Hind III 酶切(qie)位(wei)點(dian)依(yi)然存在(zai)（保留(liu)酶切(qie)位(wei)點(dian)）。

具體(ti)如下(xia)：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

無(wu)縫克隆反(fan)應(ying)的(de)操作(zuo)步驟：

註(zhu)意(yi)：2 × OneStep Cloning Mix 含(han)有(you)連接(jie)增強(qiang)劑(ji)PEG很(hen)粘(zhan)稠，從(cong)冰箱拿(na)出來(lai)溫度低時更(geng)粘(zhan)稠，可(ke)以放在(zai)手(shou)心(xin)化凍(dong)幾分鐘(zhong)提高(gao)溫度便(bian)可(ke)降(jiang)低粘(zhan)稠度(du)（不(bu)影(ying)響質量），輕(qing)彈(dan)混勻(yun)，瞬(shun)間(jian)離心(xin)收(shou)集(ji)到(dao)管(guan)底(di)。

1.   按(an)照(zhao)下(xia)表(biao)建立反(fan)應(ying)體(ti)系（可使用(yong)PCR管(guan)在(zai)室溫配制(zhi)）

* 載(zai)體壹般(ban)用(yong)20-50 ng，插入片段與載(zai)體(ti)的摩爾比(bi)在(zai)2:1-3:1之(zhi)間(jian)最(zui)佳(jia)；如果插入片段小於200bp，插入片段與載(zai)體(ti)的摩爾比(bi)用(yong)5:1 。

2.      輕(qing)輕混勻(yun)，在(zai)50°C反(fan)應(ying)15分(fen)鐘(zhong)（可在(zai)PCR儀(yi)器上進(jin)行(xing)），反(fan)應(ying)結束(shu)後，將PCR管置冰(bing)上(shang)後直接轉化或(huo)者(zhe)保存於-20°C。較(jiao)短(duan)片段例(li)如100bp-1kb只(zhi)需要15分鐘(zhong)便(bian)能(neng)獲(huo)得(de)足(zu)夠轉化子，較(jiao)長(chang)片段的連接(jie)，可以延長(chang)反應(ying)時間(jian)到(dao)60分(fen)鐘(zhong)。

3.     取5μl 反(fan)應(ying)產(chan)物按(an)照(zhao)感受態(tai)細胞(bao)說(shuo)明(ming)書(shu)進行(xing)轉(zhuan)化（如果轉化子較(jiao)少(shao)，可以(yi)將所(suo)有(you)的產(chan)物轉(zhuan)化並(bing)將(jiang)所(suo)有(you)的轉(zhuan)化液塗板）。

陽性(xing)克(ke)隆的(de)鑒定：

可(ke)根據具體(ti)情(qing)況(kuang)，選擇菌(jun)落PCR鑒定，提取質粒(li)（貨(huo)號31013-100）進行(xing)限(xian)制(zhi)性(xing)內(nei)切酶鑒定或(huo)測(ce)序鑒定。

One Step Seamless Cloning Kit無(wu)縫克隆