零背景(jing)平(ping)末(mo)端快(kuai)速連(lian)接(jie)試(shi)劑(ji)盒是壹(yi)種優良(liang)的(de)zi殺(sha)基(ji)因陽(yang)性(xing)選(xuan)擇(ze)克(ke)隆(long)系統(tong)，可(ke)以高(gao)效克(ke)隆(long)平(ping)末(mo)端 PCR 產物和任(ren)何(he)具(ju)有平(ping)末(mo)端的DNA 片(pian)段(duan)。該(gai)試(shi)劑(ji)盒對(dui)磷酸化或(huo)非磷酸化的(de) DNA 片(pian)段(duan)都(dou)有效(xiao)。 陽性(xing)選(xuan)擇(ze)載(zai)體(ti)和插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)連(lian)接(jie)僅(jin)需 5 分(fen)鐘即(ji)可獲得(de)超過(guo) 90%的陽(yang)性(xing)重(zhong)組克(ke)隆(long)。由具(ju)有(you)校(xiao)正活性(xing)的(de)聚合(he)酶(mei)擴(kuo)增的(de)平(ping)末(mo)端 PCR 產物可直(zhi)接連(lian)入(ru)克隆(long)載體(ti)。
零背景(jing)平(ping)末(mo)端快(kuai)速克隆(long)試(shi)劑(ji)盒 T4原(yuan)理載(zai)體(ti)

諾博(bo)萊(lai)德 零背景(jing)平(ping)末(mo)端快(kuai)速克隆(long)試(shi)劑(ji)盒 T4原(yuan)理載(zai)體(ti)

Zero-Blunt Simple Quick Ligation Kit
pZERO-Blunt Simple零背景(jing)平(ping)末(mo)端快(kuai)速連(lian)接(jie)試(shi)劑(ji)盒(不(bu)含MCS) 
  

目錄號(hao)：42113

試(shi)劑(ji)盒組(zu)成、儲存、穩(wen)定(ding)性(xing)：

－20℃儲存，6個(ge)月內(nei)不(bu)影響(xiang)使(shi)用(yong)效果(guo)。

具體(ti)產品的(de)參數以收(shou)到(dao)產品說明書的參(can)數為(wei)準(zhun)

產品介(jie)紹：

零背景(jing)平(ping)末(mo)端快(kuai)速連(lian)接(jie)試(shi)劑(ji)盒是壹(yi)種優良(liang)的(de)自sha基因陽(yang)性(xing)選(xuan)擇(ze)克(ke)隆(long)系統(tong)，可(ke)以高(gao)效克(ke)隆(long)平(ping)末(mo)端 PCR 產物和任(ren)何(he)具(ju)有平(ping)末(mo)端的DNA 片(pian)段(duan)。該(gai)試(shi)劑(ji)盒對(dui)磷酸化或(huo)非磷酸化的(de) DNA 片(pian)段(duan)都(dou)有效(xiao)。 陽性(xing)選(xuan)擇(ze)載(zai)體(ti)和插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)連(lian)接(jie)僅(jin)需 5 分(fen)鐘即(ji)可獲得(de)超過(guo) 90%的陽(yang)性(xing)重(zhong)組克(ke)隆(long)。由具(ju)有(you)校(xiao)正活性(xing)的(de)聚合(he)酶(mei)（如：Pfu polymerase）擴(kuo)增的(de)平(ping)末(mo)端 PCR 產物可直(zhi)接連(lian)入(ru)克隆(long)載體(ti)。連(lian)接(jie)產(chan)物(wu)可(ke)直(zhi)接轉(zhuan)化(hua)常用的(de)大腸桿(gan)菌菌株。

試(shi)劑(ji)盒提(ti)供壹(yi)個新(xin)穎(ying)的(de)自sha基因陽(yang)性(xing)選(xuan)擇(ze)克(ke)隆(long)載體(ti)pZERO-Blunt Simple。該(gai)載體(ti)含有致死的(de)自sha基因，當(dang)載(zai)體(ti)與片(pian)段(duan)連(lian)接(jie)成功(gong)，自sha基因無(wu)法(fa)正(zheng)確表達，包含(han)重組子(zi)的(de)細胞可以正(zheng)常生長；當載(zai)體(ti)與片(pian)段(duan)連(lian)接(jie)不(bu)成功(gong)，載體(ti)自連(lian)後(hou)自sha基因正(zheng)確表達，包含(han)自連(lian)空載(zai)體(ti)的細胞(bao)無(wu)法(fa)存活，即(ji)“零ZERO"背景(jing)。這種陽(yang)性(xing)篩選策(ce)略無(wu)需藍(lan)白(bai)斑(ban)篩選，極(ji)大(da)地加速了克(ke)隆(long)篩選進(jin)程。

pZERO-Blunt Simple消除了插(cha)入(ru)位點附(fu)近(jin)的多克隆(long)酶切(qie)位點，需要(yao)在(zai)PCR擴(kuo)增引(yin)物上導入(ru)合(he)適(shi)的酶切(qie)位點。此(ci)時(shi)如果(guo)使用(yong)PCR擴(kuo)增引(yin)物導(dao)入(ru)的酶(mei)切(qie)位點進(jin)行(xing)DNA酶(mei)切(qie)時，酶(mei)切(qie)反應將不(bu)會受到T載體(ti)上其它(ta)多克隆(long)酶切(qie)位點上的限制酶(mei)影響，可(ke)以大(da)大(da)提高(gao)酶切(qie)效率(lv)，增(zeng)加亞克隆(long)成功(gong)率(lv)。

操作(zuo)步驟(zhou)：

1.    連(lian)接(jie)反(fan)應的準(zhun)備(bei)：

平(ping)末(mo)端PCR產物或(huo)者(zhe)酶(mei)切(qie)後(hou)平(ping)末(mo)端片(pian)段(duan)可(ke)以通(tong)過(guo)瓊(qiong)脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)分(fen)離(li)回(hui)收（使(shi)用(yong)長(chang)波(bo)紫外(wai)光下(xia)切(qie)膠(jiao)或(huo)者(zhe)可(ke)見(jian)光透(tou)射切(qie)膠(jiao)避(bi)免(mian)DNA損傷造成連(lian)接(jie)失(shi)敗）。與載(zai)體(ti)的摩爾(er)比是 3:1。本(ben)公(gong)司生產的DNA產(chan)物快(kuai)速純(chun)化(hua)回(hui)收試(shi)劑(ji)盒對(dui)70bp以上的DNA片(pian)段(duan)能很好(hao)地進(jin)行(xing)回(hui)收。

2.  快(kuai)速連(lian)接(jie)反(fan)應：

1)   在壹個(ge)標準(zhun)的10 ml連(lian)接(jie)反(fan)應體(ti)系中，加入(ru)1 ml 40ng pZERO-Blunt Simple載體(ti)、X ml PCR產物(在(zai)通常狀況(kuang)下(xia)，沒(mei)有(you)必(bi)要(yao)對(dui)PCR產(chan)物進(jin)行(xing)精確定量，壹般(ban)PCR產物(wu)與載體(ti)的摩爾(er)比優化至1:1~10:1就(jiu)可(ke)以得(de)到良(liang)好(hao)結(jie)果(guo)，推薦(jian)3:1，見(jian)附錄(lu))、5ml 2 ´ Quick ligation Buffer和0.9ml 的T4 DNA Ligase，其余(yu)用滅(mie)菌水(shui)補(bu)足。

反應按以下(xia)體(ti)系進行(xing)：

壹般(ban)最後(hou)加入(ru)T4 DNA Ligase。

2)   22℃連(lian)接(jie)5-10分(fen)鐘（壹(yi)般(ban)可在(zai)PCR儀器完成）。

通常推薦(jian)22℃連(lian)接(jie)5-10分(fen)鐘 ，>3kb長(chang)片(pian)段(duan)連(lian)接(jie)可(ke)以延(yan)長至(zhi)30分鐘。不(bu)推薦超(chao)過(guo)30分鐘，超(chao)過可能降(jiang)低(di)轉化(hua)子數量(liang)。

3)   冰上冷卻，然(ran)後(hou)轉(zhuan)化或(huo)貯(zhu)存於-20℃。

3.   轉化：

1)   100ml感受態細胞，置(zhi)於冰上，完quan解(jie)凍後(hou)輕撣幾次將(jiang)細胞(bao)均(jun)勻懸(xuan)浮。

2)   加入(ru)4－5ml連(lian)接(jie)液(ye)(最多可全部(bu)加入(ru)，只要(yao)連(lian)接(jie)液(ye)體(ti)積(ji)不(bu)超過感受態細胞體(ti)積(ji)的(de)1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分(fen)鐘。

3)   42℃水(shui)浴(yu)熱(re)激90秒(miao)。冰上放置2~3分(fen)鐘。

4)   加500ml LB或(huo)者(zhe)SOC培(pei)養(yang)基(ji)(不含抗(kang)生素(su))，37℃ 150 rpm振(zhen)蕩培養(yang)60分(fen)鐘。

5)   將200ml細菌塗布(bu)在(zai)氨(an)芐qing黴素(su)(100mg/ml)平(ping)板上。

塗布(bu)細(xi)菌的用(yong)量依(yi)連(lian)接(jie)的(de)效(xiao)率(lv)及(ji)感受態細胞的(de)感受率(lv)而進(jin)行(xing)適(shi)當的調整，如果(guo) 預計(ji)的(de)克(ke)隆(long)較少(shao)，可(ke)通(tong)過離心(xin)（4,000rpm，2 分鐘）後(hou)吸(xi)除部(bu)分培(pei)養(yang)液(ye)，留(liu)下(xia)適(shi)量的培養(yang)基(ji)懸(xuan)浮菌體(ti)後(hou)取(qu)全部(bu)或(huo)者(zhe)適(shi)量塗布(bu)於壹(yi)個(ge)平(ping)板中(zhong)（塗布(bu)剩(sheng)余(yu)的菌液(ye)可以擱在4度保存，第(di)2天如果(guo)轉化(hua)菌落(luo)數量(liang)少(shao)，可將(jiang)剩余(yu)菌液(ye)全部(bu)塗壹(yi)個新(xin)培(pei)養(yang)板(ban))。

6)   平(ping)板在(zai)37℃下(xia)正(zheng)向放(fang)置(zhi)1小時(shi)以吸(xi)收(shou)過多的液(ye)體(ti)，然後(hou)倒(dao)置培(pei)養(yang)過(guo)夜。

4.   篩選：

5.   常規(gui)檢測(ce)：將得(de)到的(de)菌落(luo)接(jie)種 1-5 ml LB（含(han)有(you)終濃(nong)度為(wei) 100mg /ml 的氨芐(bian)qing黴素(su)）培養(yang)基(ji)，37℃搖床振(zhen)蕩培養(yang)過(guo)夜，保存菌種後(hou)提(ti)取質(zhi)粒(li)，應用 PCR 或(huo)酶切(qie)方法(fa)鑒(jian)定插入(ru)片(pian)段(duan)是否正確。

6.   快(kuai)速檢測(ce)：挑取菌落(luo)直(zhi)接進(jin)行(xing)PCR檢(jian)測(ce)（可參見(jian)分子(zi)克隆(long)第(di)3版本或(huo)者(zhe)參(can)考(kao)本(ben)公(gong)司CV05-通用(yong)T載(zai)體(ti)菌落(luo)PCR鑒(jian)定試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明書）。

7.    測(ce)序(xu)鑒(jian)定：使用試(shi)劑(ji)盒自帶引物或(huo)者(zhe)T7啟(qi)動(dong)子(zi)引物(wu)測(ce)序(xu)確定是否含有(you)目的克(ke)隆(long)。  

本試(shi)劑(ji)盒自帶測(ce)序(xu)引(yin)物(wu)（也用(yong)於菌落(luo)PCR鑒(jian)定引物）：

附錄：

ð 如何(he)計(ji)算(suan)連(lian)接(jie)反(fan)應中需要(yao)的(de)PCR產物(wu)的量(liang)?

壹般(ban)PCR產物(wu)與載體(ti)的摩爾(er)比優化至1:1~10:1（推薦(jian)3:1）就(jiu)可(ke)以得(de)到良(liang)好(hao)結(jie)果(guo)，可采用(yong)以下(xia)公(gong)式(shi)：

 [加入(ru)載體(ti)的量（ng）×插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)大(da)小(xiao)（kb）÷載體(ti)大小（kb）]×插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)和載(zai)體(ti)的摩爾(er)比=插入(ru)片(pian)段(duan)的(de)量(liang)（ng） 例如：插(cha)入(ru)片(pian)段(duan)和載(zai)體(ti)連(lian)接(jie)的(de)摩(mo)爾(er)比例為(wei)3:1，如連(lian)接(jie)反(fan)應中加入(ru)載體(ti)40ng，插入(ru)片(pian)段(duan)大(da)小(xiao)為500bp，這時應加入(ru)插入(ru)片(pian)段(duan)的(de)量(liang)為[40ng載體(ti)×0.5kb插入(ru)片(pian)段(duan)÷2.974kb載(zai)體(ti)]×3/1=20.2ng。

零背景(jing)平(ping)末(mo)端快(kuai)速克隆(long)試(shi)劑(ji)盒 T4原(yuan)理載(zai)體(ti)