許多(duo)高溫DNA聚合(he)酶，如Taq DNA聚合(he)酶、Tth DNA聚合(he)酶等(deng)擴增(zeng)的(de)PCR產物在(zai)3’-末端(duan)後都(dou)帶有(you)壹個(ge)突(tu)出(chu)的(de)堿(jian)基A，這(zhe)樣(yang)的(de)PCR產物可(ke)以用(yong)3’-末(mo)端後帶有(you)壹個(ge)突(tu)出(chu)堿(jian)基T的(de)載(zai)體方(fang)便(bian)地進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)。pBLUE-T 載(zai)體來(lai)源(yuan)於(yu)pBlueScript II SK(+) 質(zhi)粒，
pBLUE -T 載(zai)體克(ke)隆(long)試劑盒 T4原(yuan)理載(zai)體及其他(ta)

諾博萊德 pBLUE -T 載(zai)體克(ke)隆(long)試劑盒 T4原(yuan)理載(zai)體及其他(ta)

pBLUE -T 載(zai)體克(ke)隆(long)試劑盒

目(mu)錄(lu)號(hao)：42014

試劑盒組(zu)成、儲存(cun)、穩定(ding)性(xing)：

－20℃儲存(cun)，6個(ge)月內(nei)不影響(xiang)使(shi)用效果(guo)。

具體產品(pin)的(de)參(can)數以收(shou)到產品(pin)說(shuo)明書(shu)的(de)參(can)數為(wei)準(zhun)

產品(pin)介(jie)紹：

許多(duo)高溫DNA聚合(he)酶，如Taq DNA聚合(he)酶、Tth DNA聚合(he)酶等(deng)擴增(zeng)的(de)PCR產物在(zai)3’-末端後都(dou)帶有(you)壹個(ge)突(tu)出(chu)的(de)堿(jian)基A，這(zhe)樣(yang)的(de)PCR產物可(ke)以用(yong)3’-末端後帶有(you)壹個(ge)突(tu)出(chu)堿(jian)基T的(de)載(zai)體方(fang)便(bian)地進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)。pBLUE-T 載(zai)體來(lai)源(yuan)於(yu)pBlueScript II SK(+) 質(zhi)粒，在(zai)EcoRI酶切位點(dian)處(chu)添加了適當(dang)序(xu)列(lie)，經(jing)XCM I 酶切後其3’末(mo)端(duan)直(zhi)接(jie)產生未(wei)配對(dui)的(de)T堿(jian)基而成，因(yin)此有(you)更高的(de)重(zhong)組效率(lv)。pBLUE-T 載(zai)體插(cha)入(ru)位點(dian)兩(liang)端獨(du)te設(she)計(ji)的(de)兩(liang)個(ge)ECOR I位點(dian)使(shi)插入(ru)片段(duan)可(ke)以用(yong)廉價高效的(de)ECOR I單(dan)酶切檢(jian)測(ce)； 同(tong)時(shi)pBLUE-T 載(zai)體不含(han)NdeI或(huo)NcoI限(xian)制(zhi)性(xing)內(nei)切酶位點(dian)，可(ke)方(fang)便(bian)用(yong)於(yu)克(ke)隆(long)含(han)上(shang)述(shu)酶切位點(dian)的(de)基(ji)因(yin)。此外(wai)，本(ben)公司(si)載(zai)體連(lian)接(jie)體(ti)系(xi)還有(you)背景低(di)（藍(lan)斑(ban)小(xiao)於(yu)10%），重(zhong)組(zu)率(lv)高（白斑(ban)中超過90%有(you)插入(ru)片段(duan)），可(ke)快(kuai)速連(lian)接(jie)等(deng)特(te)點(dian)。本(ben)說(shuo)明(ming)書(shu)末(mo)列(lie)出(chu)了(le)pBLUE-T 載(zai)體相(xiang)關(guan)的(de)技(ji)術(shu)資料(liao)，其全(quan)序(xu)列(lie)可(ke)參(can)照(zhao)pBlueScript II SK(+)序(xu)列(lie)，只(zhi)是(shi)其多(duo)克(ke)隆(long)酶切位點(dian)處(chu)序(xu)列(lie)稍(shao)有(you)不同(tong)。

測序(xu)可(ke)以采用T3、T7啟動子(zi)引物(wu)和(he)M13通用(yong)測序(xu)引物(wu)（見(jian)後面圖(tu)譜）

操(cao)作(zuo)步驟：

1. 連(lian)接(jie)反(fan)應的(de)準(zhun)備(bei)：

PCR產物是(shi)否要(yao)進(jin)行(xing)純(chun)化(hua)取決(jue)於(yu)擴增(zeng)產物的(de)質(zhi)量(liang)。如(ru)果(guo)PCR產物非(fei)常(chang)幹(gan)凈，不經(jing)純(chun)化(hua)就(jiu)可(ke)直(zhi)接(jie)進(jin)行(xing)連(lian)接(jie)反(fan)應。但(dan)如(ru)果(guo)是以質(zhi)粒為(wei)模板的(de)PCR產物則(ze)必須進(jin)行(xing)純(chun)化(hua)，模板質粒有(you)可(ke)能(neng)也形(xing)成白斑(ban)。PCR產物可(ke)以通(tong)過瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠電(dian)泳分離。本(ben)公司(si)生(sheng)產的(de)DNA產物快(kuai)速純(chun)化(hua)回(hui)收試(shi)劑盒對(dui)70bp以上(shang)的(de)DNA片段(duan)能很(hen)好地進(jin)行(xing)回(hui)收。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合(he)酶擴增(zeng)的(de)PCR產物，其末(mo)端(duan)都(dou)帶有(you)壹個(ge)突(tu)出(chu)的(de)3’ -A。 具有(you)3’ -A末端的(de)PCR產物可(ke)以直(zhi)接(jie)用(yong)pBLUE-T 載(zai)體進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)連(lian)接(jie)。具(ju)有(you)3’®5’外(wai)切酶活性的(de)DNA聚合(he)酶（高保真酶）擴增(zeng)的(de)PCR產物是(shi)平末(mo)端，要對(dui)這(zhe)種平末端PCR產物進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)，應優(you)良(liang)行3’-端加A工作(zuo)。

2. 常(chang)規連(lian)接(jie)反(fan)應：

1) 在壹個(ge)標準(zhun)的(de)10 ml連(lian)接(jie)反(fan)應體(ti)系(xi)中，加入1 ml 30ng pBLUE-T 載(zai)體、X ml PCR產物(在(zai)通常(chang)狀(zhuang)況(kuang)下(xia)，沒(mei)有(you)必要對(dui)PCR產物進(jin)行(xing)精確(que)定量(liang)，壹般PCR產物與載(zai)體的(de)摩爾比(bi)優(you)化至2:1~10:1就(jiu)可(ke)以得到良(liang)好結(jie)果(guo)，推薦3:1)、1ml 10´ligation Buffer和(he)0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的(de)T4 DNA Ligase，其余(yu)用(yong)水(shui)補足。反(fan)應按以下(xia)體(ti)系進(jin)行(xing)：

壹般最後加入T4 DNA Ligase。

2) 16℃連(lian)接(jie)過夜(ye)（壹般可(ke)在(zai)PCR儀(yi)器完成）。

通常(chang)推薦16℃連(lian)接(jie)過夜(ye)（10ml體系標準(zhun)連(lian)接(jie)酶量(liang)為(wei)2.5 Weiss Units即可(ke)），可(ke)以得到最多的(de)轉(zhuan)化子(zi)。但(dan)是(shi)本(ben)系(xi)統(tong)含(han)PEG Enhancer可(ke)以提(ti)高連(lian)接(jie)效率(lv)數(shu)倍(bei)，在高連(lian)接(jie)酶量(liang)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)（10ml體系推薦連(lian)接(jie)酶量(liang)為(wei)5 Weiss Units）16℃連(lian)接(jie)30分鐘即(ji)可(ke)達(da)壹般研究的(de)要(yao)求(qiu)。

3) 冰上冷(leng)卻(que)，然(ran)後轉化或(huo)貯存(cun)於(yu)-20℃。

3. 快速連(lian)接(jie)反(fan)應：

1) 反(fan)應按以下(xia)體(ti)系進(jin)行(xing)：

壹般最後加入T4 DNA Ligase。

2) 22℃連(lian)接(jie)5-10分鐘（壹般可(ke)在(zai)PCR儀(yi)器完成）。

2 ´Quick Ligation Buffer已經(jing)包含(han)所(suo)有(you)優化(hua)的(de)快(kuai)速連(lian)接(jie)成份(fen)，通常(chang)推薦22℃連(lian)接(jie)10分鐘（10ml體系連(lian)接(jie)酶量(liang)為(wei)5 Weiss Units，長片段(duan)連(lian)接(jie)可(ke)以延(yan)長(chang)至(zhi)30分鐘）壹般可(ke)以得到滿意結(jie)果(guo)。此外(wai)本(ben)系(xi)統(tong)也可(ke)在(zai)16℃連(lian)接(jie)30分鐘（10ml體系連(lian)接(jie)酶量(liang)為(wei)5Weiss Units）即可(ke)達(da)壹般研究的(de)要(yao)求(qiu)。

3) 冰上冷(leng)卻(que)，然(ran)後轉化或(huo)貯存(cun)於(yu)-20℃。

4. 轉化：

ð50-100ml感受態細胞，置於(yu)冰(bing)上(shang)，完(wan)quan解凍(dong)後輕撣幾次(ci)將(jiang)細胞均勻(yun)懸浮(fu)。

ð加入4－5ml連(lian)接(jie)液(最多可(ke)全(quan)部加入，只要體(ti)積不超過感受態細胞體積的(de)1/10)，輕(qing)輕混(hun)勻(yun)。冰(bing)上放(fang)置(zhi)30分鐘。42℃水(shui)浴熱激90秒。冰上放(fang)置(zhi)2~3分鐘。

ð加500ml LB或者(zhe)SOC培(pei)養基(ji)(不含(han)抗(kang)生(sheng)素(su))，37℃ 150 rpm振(zhen)蕩培(pei)養60分鐘。

ð將(jiang)200ml細菌塗布(bu)在預(yu)先(xian)用16ml 50mg/ml IPTG和(he)40ml 20 mg/ml X-gal 塗布(bu)的(de)氨(an)芐qing黴素(su)平板(ban)上。

塗布(bu)細菌的(de)用(yong)量(liang)依(yi)連(lian)接(jie)的(de)效率(lv)及感受態細胞的(de)感受率(lv)而進(jin)行(xing)適當(dang)的(de)調整，如(ru)果(guo) 預計(ji)的(de)克(ke)隆(long)較少，可(ke)通(tong)過離心(xin)（4,000rpm，2 分鐘）後吸(xi)除部分培(pei)養液，留(liu)下適(shi)量(liang)的(de)培(pei)養基(ji)懸浮(fu)菌體後取全(quan)部或者(zhe)適(shi)量(liang)塗(tu)布(bu)於(yu)壹個(ge)平(ping)板中（塗布(bu)剩余(yu)的(de)菌液可(ke)以擱(ge)在(zai)4度保(bao)存(cun)，第(di)2天(tian)如果(guo)轉化(hua)菌落數量(liang)少(shao)，可(ke)將(jiang)剩余(yu)菌液全(quan)部塗壹個(ge)新(xin)培(pei)養板(ban))。

ð平板在37℃下正(zheng)向放(fang)置(zhi)1小(xiao)時(shi)以吸(xi)收(shou)過多的(de)液體(ti)，然(ran)後倒(dao)置培(pei)養過夜(ye)。
5 篩選(xuan)：

1). 轉化子(zi)的(de)藍(lan)白(bai)篩選(xuan)：

當(dang)外(wai)源(yuan)DNA片段(duan)插入(ru)到pBLUE-T 中後，由於(yu)外(wai)源(yuan)DNA的(de)核(he)酸(suan)序(xu)列(lie)存(cun)在(zai)改變了(le)LacZ基因(yin)的(de)編(bian)碼，從而影響(xiang)了其產物b-半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶a-片段(duan)的(de)活性，因(yin)此重組(zu)克(ke)隆(long)在X-gal/IPTG平板上呈(cheng)現為(wei)白色，而非重(zhong)組(zu)克(ke)隆(long)呈藍(lan)色。有(you)的(de)時(shi)候插入片段(duan)沒(mei)有(you)影響(xiang)lacZ 基因(yin)讀(du)碼框(kuang)， 或插(cha)入片段(duan)太小(xiao)，這(zhe)種情(qing)況(kuang)下(xia)菌落（重組(zu)克(ke)隆(long)）呈現淡藍(lan)色或(huo)者(zhe)在(zai)菌落中心(xin)呈現淡藍(lan)斑(ban)點(dian)，外(wai)圈白色（魚(yu)眼(yan)狀藍(lan)斑(ban)fish eye）。選(xuan)擇(ze)在(zai)IPTG/X-gal平(ping)板上生(sheng)長的(de)白(bai)色菌落或者(zhe)淡(dan)藍(lan)色菌落，用牙簽挑(tiao)至含(han)氨(an)芐qing黴素(su)的(de)液體(ti)培(pei)養基(ji)，37℃培(pei)養過夜(ye)。
2). 轉化子(zi)的(de)鑒(jian)定：

a. 用上述(shu)培(pei)養的(de)白(bai)色菌落的(de)菌液抽(chou)提質(zhi)粒，用(yong)ECOR I 單(dan)酶切或用(yong)其它合(he)適(shi)的(de)酶切，瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠電(dian)泳檢(jian)查(zha)片段(duan)大小(xiao)，確(que)定是(shi)否含(han)有(you)目(mu)的(de)片段(duan)。

b. 挑(tiao)取白色菌落直接(jie)進(jin)行(xing)PCR檢(jian)測(ce)（可(ke)參(can)見(jian)分子(zi)克(ke)隆(long)第(di)3版本(ben)或(huo)者(zhe)咨(zi)詢(xun)我(wo)們）

c. 用T3和(he)T7啟動子(zi)引物(wu)或(huo)其它合(he)適(shi)的(de)引物(wu)測(ce)序(xu)來(lai)確(que)定是(shi)否含(han)有(you)目(mu)的(de)克(ke)隆(long)。

如何(he)計(ji)算(suan)連(lian)接(jie)反(fan)應中需(xu)要的(de)PCR產物的(de)量(liang)?

壹般PCR產物與載(zai)體的(de)摩爾比(bi)優(you)化至2:1~10:1（推薦3:1）就(jiu)可(ke)以得到良(liang)好結(jie)果(guo)，可(ke)采用以下(xia)公式(shi)：

[加入載(zai)體的(de)量(liang)（ng）×插(cha)入(ru)片段(duan)大小(xiao)（kb）÷載(zai)體大(da)小(xiao)（kb）]×插(cha)入(ru)片段(duan)和(he)載(zai)體的(de)摩爾比(bi)=插(cha)入片段(duan)的(de)量(liang)（ng） 例(li)如：插(cha)入片段(duan)和(he)載(zai)體連(lian)接(jie)的(de)摩爾比(bi)例(li)為(wei)3:1，如連(lian)接(jie)反(fan)應中加入載(zai)體40ng，插(cha)入(ru)片段(duan)大小(xiao)為(wei)1000bp，這(zhe)時(shi)應加入插入片段(duan)的(de)量(liang)為(wei)[40ng載(zai)體×1kb插(cha)入(ru)片段(duan)÷2.984kb載(zai)體]×3/1=40.2ng。 

pBLUE -T 載(zai)體克(ke)隆(long)試劑盒 T4原(yuan)理載(zai)體及其他(ta)