菌(jun)落(luo)PCR鑒定(ding)是(shi)T載體克(ke)隆(long)連接(jie)後鑒定(ding)是(shi)否(fou)有(you)陽性(xing)克(ke)隆(long)（含(han)插入片(pian)段）最(zui)方bian快捷的方法。但是市(shi)面上能(neng)見(jian)到的(de)菌落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he)采用(yong)的都是T3,T7或(huo)者SP6等(deng)特(te)異(yi)T載體引物，只(zhi)能(neng)用(yong)於(yu)某種特(te)定(ding)T載體連接(jie)陽性(xing)克(ke)隆(long)的(de)鑒定(ding)。
通(tong)用(yong)T載體菌落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he) T4原(yuan)理載體

諾(nuo)博萊(lai)德(de) 通(tong)用(yong)T載體菌落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he) T4原(yuan)理載體

通(tong)用(yong)T載體菌落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he)

目錄號：42015

試(shi)劑盒(he)組成(cheng)、儲(chu)存(cun)、穩(wen)定(ding)性(xing)：

儲(chu)存(cun)：-20 ℃ 保存(cun)。

具(ju)體產品的參數(shu)以收(shou)到產品說明(ming)書(shu)的(de)參數(shu)為(wei)準(zhun)

產品介紹：

菌落(luo)PCR鑒定(ding)是(shi)T載體克(ke)隆(long)連接(jie)後鑒定(ding)是(shi)否(fou)有(you)陽性(xing)克(ke)隆(long)（含(han)插入片(pian)段）最(zui)方bian快捷的方法。但是市(shi)面上能(neng)見(jian)到的(de)菌落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he)采用(yong)的都是T3,T7或(huo)者SP6等(deng)特(te)異(yi)T載體引物，只(zhi)能(neng)用(yong)於(yu)某種特(te)定(ding)T載體連接(jie)陽性(xing)克(ke)隆(long)的(de)鑒定(ding)。如果使用(yong)不(bu)同(tong)T載體，便需(xu)同(tong)時購(gou)買多種(zhong)鑒定(ding)試(shi)劑盒(he)，大大(da)增加(jia)了(le)使用(yong)成(cheng)本(ben)。本(ben)公(gong)司(si)采用(yong)通(tong)用(yong)T載體引物研(yan)制的(de)通(tong)用(yong)T載體菌落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he)，只需(xu)購買壹(yi)種試(shi)劑盒(he)，便可(ke)用(yong)於(yu)市(shi)面上所(suo)有(you)常見(jian)的T載體(包(bao)括(kuo)pGEM，pUC，pBluescript系(xi)列) 連接(jie)陽性(xing)克(ke)隆(long)的(de)鑒定(ding)。此(ci)外(wai)，采用(yong)T3,T7或(huo)者SP6做引物的(de)菌(jun)落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he)引物距(ju)離插(cha)入位(wei)點的(de)距(ju)離非(fei)常短，因此在鑒定(ding)100bp左(zuo)右(you)或(huo)者更(geng)小(xiao)片(pian)段的插(cha)入時(shi)，陰性(xing)克(ke)隆(long)的(de)引物二(er)聚(ju)體條(tiao)帶和陽性(xing)克(ke)隆(long)擴(kuo)增條(tiao)帶大(da)小(xiao)接(jie)近，無(wu)法區(qu)分。往往(wang)把引物二(er)聚(ju)體的條(tiao)帶看(kan)成(cheng)是(shi)陽性(xing)擴(kuo)增條(tiao)帶，造(zao)成(cheng)假(jia)陽性(xing)。反(fan)之，造(zao)成(cheng)假(jia)陰性(xing)。本(ben)試(shi)劑盒(he)通(tong)用(yong)T載體引物在未(wei)插(cha)入片(pian)段時的(de)距(ju)離至(zhi)少有150bp以上，加(jia)上插(cha)入片(pian)段的長(chang)度，可(ke)以清(qing)晰(xi)的區(qu)分是插(cha)入片(pian)段擴(kuo)增出的(de)條(tiao)帶還是引物二(er)聚(ju)體擴(kuo)增出的(de)條(tiao)帶。避(bi)免假陽性(xing)或(huo)者假陰性(xing)，大(da)大(da)提高(gao)了(le)準(zhun)確(que)性。本(ben)公(gong)司(si)研(yan)發的(de)壹(yi)管便攜(xie)式PCR MasterMix預(yu)混系(xi)統，無(wu)需(xu)您(nin)壹(yi)壹(yi)加入各(ge)種(zhong)成(cheng)分，直(zhi)接(jie)加入需(xu)篩選單(dan)菌落(luo)，經過(guo)1小(xiao)時(shi)左(zuo)右(you)的(de)PCR反(fan)應(ying)和電(dian)泳檢(jian)測(ce)即(ji)可(ke)得到(dao)重(zhong)組菌(jun)落(luo)鑒定(ding)的(de)結(jie)果。

預期擴(kuo)增片(pian)段：

註意(yi)事(shi)項(xiang)：

1.        重(zhong)組菌(jun)落(luo)鑒定(ding)時(shi)，挑(tiao)取單菌落(luo)前(qian)，應先(xian)做好(hao)標(biao)記，便於(yu)鑒定(ding)後使(shi)用(yong)。

2.     挑(tiao)取菌落(luo)時，應(ying)選擇(ze)單菌落(luo)，不(bu)要(yao)挑(tiao)取太(tai)多菌(jun)體，以免影(ying)響(xiang)PCR 結(jie)果。

3.    設(she)定(ding)PCR 程(cheng)序(xu)時，請根(gen)據插(cha)入片(pian)段大小(xiao)決(jue)定(ding)延伸(shen)時(shi)間，如果插入片(pian)段大小(xiao)為(wei)1 kb 以下(xia)，延伸(shen)時(shi)間30-45 秒即(ji)可(ke)，如果片段更(geng)長(chang)，可(ke)按(an)此比例增加(jia)延伸(shen)時(shi)間。

操作步(bu)驟（以25ml體系(xi)舉(ju)例，客戶(hu)也(ye)可以采(cai)用(yong)20ml體系(xi)）：

1.   按以下(xia)體系(xi)配好(hao)含(han)有引物的(de)1 x Taq MasterMix 反(fan)應液(ye)。

2.將過(guo)夜培(pei)養的平板上的(de)菌(jun)落(luo)編(bian)號後，使(shi)用(yong)滅菌的槍頭(tou)挑(tiao)取壹(yi)部(bu)分單菌(jun)落(luo)加入上述(shu)反(fan)應液(ye)，吹(chui)打混(hun)勻(yun)使(shi)菌落(luo)充分分散到(dao)反應液中。

可多設(she)置(zhi)壹(yi)管不(bu)加(jia)菌(jun)落(luo)的陰性(xing)對(dui)照(zhao)，以便於(yu)分析實(shi)驗(yan)結(jie)果。

3.將PCR管置(zhi)於(yu)熱循環(huan)儀上按(an)以下(xia)條(tiao)件開(kai)始(shi)反應(ying)，建(jian)議條(tiao)件如下：

94℃ 10 min

94℃ 30 sec

55℃ 30 sec        30-33 cycles

72℃ 0.5-1 min

72℃ 5 min

註意(yi)：延伸(shen)時(shi)間請根(gen)據插(cha)入片(pian)段大小(xiao)調(tiao)整(zheng)。預(yu)變性時(shi)間延長(chang)到(dao)10分鐘(zhong)，主要(yao)是(shi)為了(le)裂解(jie)菌(jun)落(luo)，釋(shi)放DNA模(mo)板。

反應結(jie)束(shu)後，取5-10ml直(zhi)接(jie)上樣(yang)電(dian)泳檢(jian)測(ce)。

註：如果細菌(jun)難裂解(jie)或(huo)者雜質(zhi)多假(jia)陰性(xing)，嘗試(shi)下面的方法，裂解(jie)釋(shi)放DNA後進(jin)行(xing)。

1.     挑(tiao)取菌落(luo)加入 50ml dd水 （或(huo)者10ml dd水中），振搖。

2.    99 度，10分鐘(zhong)滅(mie)活菌(jun)液(ye)中的(de)酶，並(bing)釋(shi)放DNA。

3.      12000rpm 離心 1分鐘(zhong)去(qu)除細(xi)胞碎片。

4.      取上清(qing) PCR，25ml PCR體系(xi)取5ml上清(qing)（起(qi)始(shi)50ml dd水），或(huo)者1ml上清(qing)（起(qi)始(shi)10ml dd水）做模(mo)板(ban)。

通(tong)用(yong)T載體菌落(luo)PCR鑒定(ding)試(shi)劑盒(he) T4原(yuan)理載體