超(chao)氧(yang)化(hua)物(wu)歧(qi)化(hua)酶(mei)（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒(he)說(shuo)明書（WST-8 法）

微量(liang)法 100 管/96 樣(yang)

正(zheng)式測定(ding)前(qian)務必(bi)取 2-3 個預期差(cha)異(yi)較(jiao)大(da)的樣(yang)本(ben)做預測定(ding)測(ce)定(ding)意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣(guang)泛存(cun)在於動物、植(zhi)物、微生物和培(pei)養(yang)細胞中，催化(hua)超(chao)氧化(hua)物(wu)陰離(li)子發生岐化(hua)作用，生成(cheng)H2O2 和O2。SOD 不僅是(shi)超(chao)氧化(hua)物(wu)陰離(li)子清(qing)除酶(mei)，也是(shi)H2O2 主(zhu)要(yao)生成(cheng)酶(mei)，在生物抗(kang)氧化(hua)系(xi)統中具(ju)有重要(yao)作用。

測(ce)定(ding)原(yuan)理(li)：

通過(guo)黃piao呤及黃piao呤氧化(hua)酶(mei)反(fan)應(ying)系統產生超氧(yang)陰離(li)子(O^2-.)，O^2-.可與(yu)WST-8 反(fan)應(ying)產生水溶性染料(liao)甲(jia)臜(臜)，後者(zhe)在 450nm 處有吸收(shou)；SOD 可清(qing)除O^2-.，從而抑(yi)制了(le)甲(jia)臜(臜)的形(xing)成(cheng)；反(fan)應(ying)液黃色越深，說(shuo)明SOD 活(huo)性(xing)愈(yu)低(di)，反(fan)之(zhi)活(huo)性(xing)越(yue)高(gao)。

組(zu)成(cheng)：

超氧化(hua)物(wu)歧(qi)化(hua)酶(mei)試劑盒(he) 抗(kang)逆(ni)

自備(bei)儀(yi)器(qi)和用(yong)品：

酶(mei)標(biao)儀、離(li)心機、移液(ye)器(qi)、96 孔(kong)板、研(yan)缽、冰和蒸餾(liu)水

粗酶(mei)液(ye)提(ti)取：

1、細菌(jun)、細胞或(huo)組(zu)織(zhi)樣(yang)品的制備(bei)：

細(xi)菌(jun)或(huo)培(pei)養(yang)細胞：先(xian)收集(ji)細菌(jun)或(huo)細(xi)胞到離(li)心管內，離(li)心後棄(qi)上(shang)清(qing)；按(an)照細菌(jun)或(huo)細(xi)胞數量（104 個）：提(ti)取液體積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的比(bi)例(li)（建議 500 萬細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞加(jia)入 1ml 提(ti)取液），超聲波(bo)破(po)碎細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞（冰浴，功率 20％或(huo) 200W，超(chao)聲(sheng) 3s，間(jian)隔 10s，重(zhong)復 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰上(shang)待(dai)測。

組(zu)織(zhi)：按(an)照組(zu)織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：提(ti)取液體積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的比(bi)例(li)（建議稱(cheng)取約 0.1g 組(zu)織(zhi)，加(jia)入 1ml 提(ti)取液），進行(xing)冰浴勻(yun)漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰上(shang)待(dai)測。

2、血清(qing)（漿(jiang)）樣(yang)品：直(zhi)接(jie)檢測。

測(ce)定(ding)步(bu)驟：

1、酶(mei)標(biao)儀預熱 30min 以(yi)上(shang)，調(tiao)節(jie)波(bo)長(chang)至(zhi) 450nm。

2、試劑三(san)的稀(xi)釋：將試劑三(san)用蒸餾(liu)水稀釋 50 倍，用(yong)多少(shao)配(pei)多(duo)少(shao)。（試劑三(san)和蒸餾(liu)水 1：49 稀釋。

3、工作液配(pei)制：在試劑壹(yi)加(jia)入 100μl 試劑二(er)，充分(fen)混(hun)勻(yun)。配(pei)好(hao)的試劑 4℃避(bi)光可保(bao)存(cun)壹(yi)周。（若(ruo)壹(yi)次(ci)性測定(ding)樣(yang)本(ben)較(jiao)少(shao)，可(ke)按(an)照實際用量(liang)將試劑壹(yi)和試劑二(er)按(an)照 20ml：0.1ml 的比(bi)例(li)混勻(yun)配(pei)制）

4、將壹(yi)瓶試劑四用(yong) 5ml 蒸餾(liu)水溶解（溶解後壹(yi)周內(nei)用(yong)完）。

5、樣(yang)本(ben)測定(ding)（在 96 孔(kong)板中(zhong)依(yi)次(ci)加(jia)入下列試劑）

充分(fen)混(hun)勻(yun)，室溫(wen)靜(jing)置 30min 後，450nm 處(chu)測(ce)定(ding)各管(guan)吸(xi)光值(zhi) A。

註意事項(xiang)

1、試劑三(san)為(wei)酶(mei)，不可冷(leng)凍，使用時在冰上(shang)放置。

2、對照管只(zhi)需要做壹(yi)管。

3、SOD 為(wei)什麽(me)有的樣(yang)本(ben)測定(ding)管(guan)大(da)於(yu)對照管，對(dui)照管數值在什麽(me)範圍？

對照管的範圍是 0.4-1。對照管吸(xi)光值(zhi)過(guo)低(di)可能(neng)是(shi)（1）試劑三(san)活(huo)性(xing)低(di)，可以適(shi)當(dang)減(jian)少(shao)稀(xi)釋倍數；（2)沒(mei)有按順(shun)序(xu)加(jia)試劑；（3）反(fan)應(ying)時間(jian)不夠(gou)，可以(yi)延(yan)長(chang)反(fan)應(ying)時間(jian)（反(fan)應(ying)時間(jian) 30min 可以(yi)延(yan)長(chang)到 40min）。對(dui)照管吸(xi)光值(zhi)過(guo)高(gao)可能(neng)是(shi)試劑三(san)未按(an)操(cao)作說(shuo)明書稀(xi)釋相應倍數。

若出現測(ce)定(ding)管(guan)大(da)於(yu)對照管，可(ke)能(neng)是(shi)樣(yang)本(ben)中雜質(zhi)的影(ying)響(xiang)太大(da)，為(wei)了(le)降低(di)雜質(zhi)的影(ying)響(xiang)壹(yi)般(ban)將樣(yang)本(ben)提(ti)取上(shang)清(qing)液(ye)用(yong)蒸餾(liu)水或(huo)提(ti)取液稀釋 10 倍後(hou)再(zai)測(ce)，通(tong)常(chang)可以(yi)使測定(ding)正(zheng)常(chang)。計算公(gong)式(shi)中乘(cheng)以相應稀(xi)釋倍數。

SOD 活(huo)性(xing)計算：

1、抑制百(bai)分(fen)率的計算

抑制百(bai)分(fen)率＝(A 對照管－A 測(ce)定(ding)管(guan)) ÷A 對(dui)照管× 100%

盡量(liang)使樣(yang)本(ben)的抑(yi)制百(bai)分(fen)率在 10-90%範圍內。如果計算出來的抑(yi)制百(bai)分(fen)率小於(yu) 10%或(huo)大(da)於(yu) 90%，則(ze)通(tong)常(chang)需要調整(zheng)加(jia)樣(yang)量(liang)後重新測(ce)定(ding)。如果測(ce)定(ding)出(chu)來(lai)的抑(yi)制百(bai)分(fen)率偏高(gao)，則(ze)需將樣(yang)本(ben)用提(ti)取液適(shi)當(dang)稀釋；如果測(ce)定(ding)出(chu)來(lai)的抑(yi)制百(bai)分(fen)率偏低(di)，則(ze)需重新準(zhun)備(bei)濃(nong)度比(bi)較(jiao)高(gao)的待(dai)測樣(yang)本(ben)。

2、SOD 酶(mei)活(huo)性(xing)單(dan)位(wei)：在上(shang)述(shu)黃piao呤氧化(hua)酶(mei)藕(ou)聯反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)抑制百(bai)分(fen)率為(wei) 50%時，反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)的 SOD 酶(mei)活(huo)力定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個酶(mei)活(huo)力單位(wei)(U/ml)。

3、SOD 酶(mei)活(huo)性(xing)計算：

（1） 血清(qing)（漿(jiang)）SOD 活(huo)性(xing)(U/ml)=[抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率)×V 反(fan)總(zong)]÷V 樣(yang)

=20×抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率)

（2） 組(zu)織(zhi)、細(xi)菌(jun)或(huo)培(pei)養(yang)細胞SOD 活(huo)力計算：

a.  按樣(yang)本(ben)蛋白(bai)濃(nong)度計算

SOD 活(huo)性(xing)(U/mg prot)=[抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率)×V 反(fan)總(zong)]÷(V 樣(yang)×Cpr)

=20×抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率)÷Cpr

需要另外(wai)測(ce)定(ding)，建議使用本(ben)公(gong)司(si)BCA 蛋白(bai)質(zhi)含(han)量(liang)測(ce)定(ding)試劑盒(he)。

b.  按(an)樣(yang)本(ben)鮮重計算

SOD 活(huo)性(xing)(U/g 鮮重)=[抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率)×V 反(fan)總(zong)]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))

=20×抑制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率)÷W c.按細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞個數計算

SOD 活(huo)力(U/10⁴ cell)=[抑制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率) ×V 反(fan)總(zong)]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))

=0.04×抑制百(bai)分(fen)率÷(1－抑制百(bai)分(fen)率)

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)體系(xi)總(zong)體積(ji)，0.2ml；V 樣(yang)：加(jia)入反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.01ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提(ti)取液體積(ji)，1 ml；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白(bai)質(zhi)濃(nong)度，mg/ml ；W：樣(yang)本(ben)質(zhi)量(liang)，g；500：細(xi)胞或(huo)細(xi)菌(jun)總數，500 萬。

超(chao)氧化(hua)物(wu)歧(qi)化(hua)酶(mei)試劑盒(he) 抗(kang)逆(ni)