過氧(yang)化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒說明(ming)書(shu)

分光光度(du)法(fa) 50 管/48 樣

正式(shi)測定前務必(bi)取 2-3 個預期(qi)差(cha)異較大(da)的(de)樣本(ben)做預測定測定意義(yi)：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在(zai)於(yu)動(dong)物、植物、微生(sheng)物和培養(yang)細(xi)胞中(zhong)，可(ke)催(cui)化過氧(yang)化氫氧(yang)化酚(fen)類(lei)和(he)胺類(lei)化合物，具有(you)消(xiao)除過氧(yang)化氫和(he)酚(fen)類(lei)、胺類(lei)毒性的(de)雙(shuang)重作(zuo)用(yong)。

測定原理：

POD 催(cui)化H2O2 氧化特定底(di)物，在(zai) 470nm 有(you)特征(zheng)光吸收(shou)。

組(zu)成(cheng)：

過氧(yang)化物酶試劑盒 抗逆

自備(bei)儀(yi)器(qi)和用(yong)品：

可(ke)見(jian)分光光度(du)計、臺式(shi)離心(xin)機(ji)、可(ke)調(tiao)式(shi)移(yi)液(ye)器(qi)、1 ml 玻璃(li)比色皿(min)、研(yan)缽(bo)、冰(bing)和蒸餾(liu)水。

粗酶液提(ti)取：

1、細(xi)菌、細(xi)胞或(huo)組(zu)織(zhi)樣品的(de)制備(bei)：

細(xi)菌或(huo)培養(yang)細(xi)胞：先收(shou)集(ji)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞到(dao)離心(xin)管內(nei)，離(li)心後棄(qi)上(shang)清(qing)；按(an)照(zhao)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞數(shu)量(liang)（10⁴ 個）：提取液體(ti)積（ml）為 500~1000：1 的(de)比(bi)例（建(jian)議 500 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞加入 1ml 提(ti)取液），超(chao)聲波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞（冰(bing)浴，功(gong)率(lv) 20％或 200W，超(chao)聲 3s，間隔 10s，重復(fu) 30 次）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清(qing)，置(zhi)冰(bing)上(shang)待測(ce)。

組織：按(an)照(zhao)組織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：提(ti)取液體(ti)積(ml)為 1：5~10 的(de)比(bi)例（建(jian)議稱(cheng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提(ti)取液），進行(xing)冰(bing)浴勻漿。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清(qing)，置(zhi)冰(bing)上(shang)待測(ce)。

2、血清(qing)（漿）樣品：直接(jie)檢(jian)測(ce)。

測(ce)定步驟(zhou)和(he)加樣表：

1、分(fen)光光度(du)計預熱 30min 以上(shang)，調(tiao)節波(bo)長至(zhi) 470nm，蒸餾(liu)水調(tiao)零(ling)。

2、工作液(ye)的(de)配制：臨用(yong)前將(jiang)試劑壹、試(shi)劑二、試劑三(san)按(an)照(zhao) 2.6（ml）：1.5（μl）：1（μl）的(de)比(bi)例混勻；在(zai) 37℃（哺乳(ru)動(dong)物）或 25℃（其(qi)它物種）預熱 10min 以上(shang)；現(xian)配現(xian)用(yong)。

3、在(zai) 1ml 玻璃(li)比色皿(min)中(zhong)加入 50μl 樣本(ben)和 950μl 工作液(ye)，混勻，記錄 470nm 下(xia) 1min 時(shi)吸光值A1 和(he) 2min後的(de)吸(xi)光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

註(zhu)意：

如(ru)果(guo)ΔA 小於(yu) 0.005，可(ke)將(jiang)反應時(shi)間延(yan)長到(dao) 5min。如果(guo)ΔA 大(da)於(yu) 0.5，可(ke)將(jiang)樣本(ben)用(yong)提取液稀釋後測定，計算公(gong)式中(zhong)乘以相應(ying)稀釋倍(bei)數(shu)。

POD 活性(xing)計算：

1、血(xue)清(qing)（漿）POD 活性(xing)

單(dan)位(wei)定義：每 ml 血(xue)清(qing)（漿）在(zai)每 ml 反應體(ti)系中(zhong)每分鐘A470 變(bian)化 0.01 為壹(yi)個酶活力單位。計算公(gong)式：

POD（U/ml）=ΔA×V 反總(zong)÷V 樣÷0.01÷T =2000×ΔA

2、組織(zhi)、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞POD 活性(xing)

(1) 按(an)樣本(ben)蛋(dan)白(bai)濃度(du)計算

單(dan)位定義：每 mg 組(zu)織(zhi)蛋(dan)白(bai)在(zai)每ml 反應體(ti)系中(zhong)每分鐘 A470 變(bian)化 0.01 為壹(yi)個酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總(zong)÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

（2） 按(an)樣本(ben)鮮重計算

單(dan)位定義：每 g 組(zu)織(zhi)在(zai)每ml 反應體(ti)系中(zhong)每分鐘A470 變(bian)化 0.01 為壹(yi)個酶活力單位。

POD（U/g 鮮(xian)重(zhong)）＝ΔA×V 反總(zong)÷(W× V 樣÷V 樣總(zong))÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

（3） 按(an)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密度(du)計算

單(dan)位定義：每 1 萬(wan)個細(xi)菌或(huo)細(xi)胞在(zai)每ml 反應體(ti)系中(zhong)每分鐘A470 變(bian)化 0.01 為壹(yi)個酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總(zong)÷(500×V 樣÷V 樣總(zong))÷0.01÷T =4×ΔA

V 反總(zong)：反應體(ti)系總(zong)體(ti)積，1ml； V 樣：加入樣本(ben)體(ti)積，0.05ml；V 樣總(zong)：加入提(ti)取液體(ti)積，1 ml；T：反應時(shi)間，1 min；Cpr：樣本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量(liang)；500：細(xi)菌或(huo)細(xi)胞總(zong)數(shu)，500 萬。

過氧(yang)化物酶試劑盒 抗逆