過(guo)氧化氫酶（Catalase，CAT）試(shi)劑(ji)盒（鉬酸(suan)銨(an)比色法）說明(ming)書(shu)

分光(guang)光(guang)度法 50 管(guan)/48樣(yang)

過(guo)氧化氫酶試(shi)劑(ji)盒 鉬酸(suan)銨(an)比色法 抗逆

正(zheng)式測定(ding)前務(wu)必(bi)取 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差異較(jiao)大的(de)樣(yang)本做(zuo)預(yu)測定(ding)測定(ding)意(yi)義(yi)：

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存(cun)在於(yu)動物(wu)、植(zhi)物(wu)、微(wei)生(sheng)物和培(pei)養細(xi)胞(bao)中(zhong)，是最(zui)主要(yao)的(de)H2O2 清(qing)除酶，在活(huo)性氧清除系(xi)統(tong)中(zhong)具(ju)有重要(yao)作(zuo)用。

測(ce)定(ding)原理(li)：

組成(cheng)：

自(zi)備(bei)儀(yi)器和(he)用(yong)品(pin)：

可見(jian)分光(guang)光(guang)度計(ji)、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機、可調式(shi)移液器、1 ml 玻(bo)璃(li)比色皿(min)、研缽(bo)、冰和蒸(zheng)餾(liu)水。

粗(cu)酶(mei)液提(ti)取：

1、細(xi)菌、細(xi)胞(bao)或組織(zhi)樣(yang)品(pin)的(de)制(zhi)備(bei)：

細(xi)菌或(huo)培(pei)養細(xi)胞(bao)：先收集細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)到離心(xin)管內(nei)，離心後棄(qi)上(shang)清(qing)；按(an)照細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)（104 個）：提(ti)取液體(ti)積（ml）為 500~1000：1 的(de)比例（建議 500 萬細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)加(jia)入 1ml 提取液），超(chao)聲波(bo)破(po)碎細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)（冰浴，功(gong)率(lv) 20％或 200W，超(chao)聲 3s，間隔(ge) 10s，重復 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

組織(zhi)：按照組織(zhi)質量(liang)（g）：提取液體(ti)積(ml)為 1：5~10 的(de)比例（建議稱取約 0.1g 組織(zhi)，加(jia)入 1ml 提取液），進(jin)行冰(bing)浴(yu)勻(yun)漿(jiang)。8000g 4℃離心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

2、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）樣(yang)品(pin)：直(zhi)接(jie)檢(jian)測。

測(ce)定(ding)步驟(zhou)：

1、分光(guang)光(guang)度計(ji)預(yu)熱(re) 30min 以(yi)上(shang)，調(tiao)節(jie)波(bo)長至 405 nm。

2、在(zai)EP 管(guan)中(zhong)加(jia)入下列試劑(ji)

CAT 活(huo)性計(ji)算：

1、標(biao)準(zhun)曲線：y = 0.18x + 0.0013       R2 = 1          x：體(ti)系(xi)中(zhong)過(guo)氧化氫濃(nong)度變化值(zhi)（μmol/ml）

y：吸光(guang)值(zhi)差值(zhi)ΔA

2、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）CAT 活(huo)力的(de)計(ji)算:

單(dan)位的(de)定(ding)義：每毫升(sheng)血(xue)清(qing)（漿(jiang)）每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化 1μmol H2O2 降解定(ding)義為(wei)壹個酶(mei)活(huo)力單位。

CAT(μmol /min/ml)= =(ΔA-0.0013)÷0.18×V 反總(zong)÷V 樣(yang)÷T

=222.22×(ΔA-0.0013)

3、組織(zhi)、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)中(zhong) CAT 活(huo)力計(ji)算：

（1）   按(an)樣(yang)本蛋白(bai)濃(nong)度計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義：每mg 組織(zhi)蛋白(bai)每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化 1μmol H2O2 降解定(ding)義為(wei)壹個酶(mei)活(huo)力單位。

CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.18×V 反總(zong)÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=222.22×(ΔA-0.0013)÷Cpr

（2）   按(an)樣(yang)本鮮(xian)重計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義：每g 組織(zhi)每分鐘(zhong)催(cui)化 1μmol H2O2 降解定(ding)義為(wei)壹個酶(mei)活(huo)力單位。

CAT(μmol/min/g 鮮(xian)重)=(ΔA-0.0013)÷0.18×V÷（W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）÷T=222.22×(ΔA-0.0013)÷W

V 反總(zong)：反應體系總(zong)體積，1.2 ml；V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本體積，0.015 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提取液體(ti)積，1 ml；T：反應時(shi)間(jian)，2 min；W：樣(yang)本質量(liang)，g；Cpr：樣(yang)本蛋白(bai)質濃(nong)度，mg/ml。

註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)：

1、預(yu)實驗若(ruo)發(fa)現酶活(huo)性過(guo)高（A 測(ce)定＜0.1），可用提(ti)取液適(shi)當(dang)稀釋樣(yang)品(pin)後測(ce)定(ding)，並在計(ji)算公(gong)式(shi)中(zhong)乘以(yi)相應稀釋倍(bei)數(shu)。

2、若(ruo) A 空(kong)白(bai)＜A 測(ce)定，壹方面(mian)可能(neng)是(shi)酶活性過(guo)低，可將反應時(shi)間(jian) 2 延長到 5min,另壹(yi)方面(mian)可能(neng)樣(yang)本中(zhong)雜質幹(gan)擾(rao)嚴(yan)重(zhong)，可將樣(yang)本稀釋 5 倍(bei)左右(you)後測(ce)定(ding)，並在計(ji)算公(gong)式(shi)中(zhong)代(dai)入實際(ji)反應時(shi)間(jian)和(he)乘以(yi)相應稀釋倍(bei)數(shu)。

過(guo)氧化氫酶試(shi)劑(ji)盒 鉬酸(suan)銨(an)比色法 抗逆