多(duo)酚氧(yang)化酶(mei)（polyphenol oxidase，PPO）試(shi)劑盒(he)說(shuo)明書(shu)

分光光度法 50 管(guan)/24 樣(yang)

多(duo)酚氧(yang)化酶(mei)試(shi)劑盒(he) 抗逆(ni)

正(zheng)式測定前務必取(qu) 2-3 個(ge)預期差(cha)異(yi)較大的樣(yang)本做(zuo)預測定測定意義(yi)：

PPO（EC1.10.3.1）主(zhu)要存(cun)在於(yu)動物(wu)、植(zhi)物、微(wei)生物(wu)和培養細胞(bao)中(zhong)，是(shi)壹(yi)種含(han)銅的氧(yang)化酶(mei)，能使壹(yi)元酚和(he)二元酚氧(yang)化產(chan)生醌，從而(er)引(yin)起褐化，與(yu)果蔬(shu)加工(gong)、茶(cha)葉品(pin)質(zhi)和組(zu)培等密(mi)切(qie)相(xiang)關。

測定原(yuan)理(li)：

PPO 能(neng)夠(gou)催(cui)化鄰(lin)苯(ben)二酚產(chan)生醌，後(hou)者(zhe)在(zai) 525nm 有特(te)征光吸收。

組(zu)成：

自(zi)備(bei)儀(yi)器(qi)和(he)用(yong)品(pin)：

可見分光光度計(ji)、臺式(shi)離(li)心機(ji)、水浴(yu)鍋、可調式移(yi)液(ye)器(qi)、1ml 玻璃比色皿(min)、研缽、冰和蒸餾(liu)水(shui)。

粗酶(mei)液(ye)提取(qu)：

1、細菌(jun)、細胞(bao)或(huo)組(zu)織樣(yang)品的制(zhi)備(bei)：

細菌(jun)或(huo)培養細胞(bao)：先收集(ji)細菌(jun)或(huo)細胞(bao)到離(li)心管(guan)內(nei)，離(li)心後(hou)棄上(shang)清(qing)；按(an)照(zhao)細菌(jun)或(huo)細胞(bao)數量（10⁴ 個）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的比例(li)（建(jian)議(yi) 500 萬(wan)細菌(jun)或(huo)細胞(bao)加入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），超聲波(bo)破(po)碎細菌(jun)或(huo)細胞(bao)（冰(bing)浴(yu)，功率(lv) 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3s，間隔(ge) 10s，重復(fu) 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰上(shang)待(dai)測。

組(zu)織：按照(zhao)組(zu)織質(zhi)量（g）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的比例(li)（建(jian)議(yi)稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組(zu)織，加入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），進(jin)行(xing)冰(bing)浴勻漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰上(shang)待(dai)測。

2、血(xue)清(qing)（漿）或果汁樣(yang)本的處(chu)理(li)：

按(an)照(zhao)血(xue)清(qing)（漿）或果汁體(ti)積(ji)（ml）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的比例(li)（建(jian)議(yi)取(qu) 0.1ml 血(xue)清(qing)（漿）或果(guo)汁加入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），進(jin)行(xing)冰(bing)浴勻漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰上(shang)待(dai)測。

測定步(bu)驟(zhou)：

1、分光光度計(ji)預熱(re) 30min 以上(shang)，調節波(bo)長(chang)至 525nm，蒸餾水(shui)調零。

2、樣(yang)本測定（在(zai)EP 管(guan)中依次(ci)加入(ru)下(xia)列試(shi)劑）

37℃(哺乳(ru)動物(wu))或(huo) 25℃（其(qi)它物種）中(zhong)準確(que)水浴(yu) 10min 後(hou)，95℃水(shui)浴(yu) 5min 充(chong)分混勻，10000g，25℃離(li)心 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，525nm 處(chu)檢測測定管(guan)和對照(zhao)管(guan)吸光度。ΔA=A 測定管(guan)-A 對照(zhao)管(guan)。

註意事(shi)項

煮(zhu)沸樣(yang)本的操(cao)作(zuo)：取(qu) 300μl 離(li)心上(shang)清(qing)於(yu)EP 管(guan)中，進(jin)行(xing) 5min 95℃水(shui)浴(yu)處理；每(mei)個測定管(guan)需(xu)要設(she)壹(yi)個對照(zhao)管(guan)，可以在(zai)不(bu)同對照(zhao)管(guan)中加入(ru)不(bu)同(tong)樣(yang)品的粗酶(mei)液(ye)，然(ran)後(hou)集(ji)中進(jin)行(xing) 5min 95℃水(shui)浴處理。

PPO 活(huo)性(xing)計(ji)算(suan)：

1、血(xue)清(qing)（漿）或(huo)果(guo)汁PPO 活(huo)性(xing)

單位的定(ding)義(yi)：每分鐘每ml 血(xue)清(qing)（漿）或果汁在每(mei) ml 反(fan)應(ying)體(ti)系中使(shi) 525nm 處吸光值變化

0.01 為(wei)壹個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PPO（U/ml）=ΔA×V 反(fan)總(zong)÷(V 液(ye)× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V 液(ye)

2、組(zu)織、細菌(jun)或(huo)細胞(bao)PPO 活(huo)性(xing)

按(an)樣(yang)本蛋白(bai)濃度計(ji)算(suan)：

單位定義(yi)：每(mei)分鐘每 mg 組(zu)織蛋白(bai)在每ml 反(fan)應(ying)體(ti)系中使(shi) 525nm 處(chu)吸(xi)光值變化 0.01 為(wei)壹個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（V 樣(yang)×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此(ci)法(fa)需(xu)要自行(xing)測定樣(yang)本蛋白(bai)質(zhi)濃度。

按(an)樣(yang)本鮮重計(ji)算(suan)：

單位定義(yi)：每(mei)分鐘每 g 組(zu)織在每ml 反(fan)應(ying)體(ti)系中使(shi) 525nm 處(chu)吸(xi)光值變化 0.01 為(wei)壹個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總(zong)÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

按(an)細菌(jun)或(huo)細胞(bao)密(mi)度(du)計(ji)算(suan)：

單位定義(yi)：每(mei)分鐘每 1 萬(wan)個細菌(jun)或(huo)細胞(bao)在(zai)每ml 反(fan)應(ying)體(ti)系中使(shi) 525nm 處(chu)吸(xi)光值變化 0.01 為(wei)壹個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反(fan)總(zong)÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反應(ying)體(ti)系總體(ti)積(ji)，1.08ml；V 液(ye)：加入(ru)血(xue)清(qing)（漿(jiang)）或(huo)果(guo)汁體(ti)積(ji)，0.1ml；V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本體(ti)積(ji)，0.18ml； V 樣(yang)總：加入(ru)提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)，1 ml；T：反(fan)應(ying)時間，10 min；Cpr：樣(yang)本蛋白(bai)質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量， g；500：細胞(bao)或(huo)細菌(jun)總(zong)數，500 萬(wan)。

多(duo)酚氧(yang)化酶(mei)試(shi)劑盒(he) 抗逆(ni)