常(chang)見的離(li)心柱(zhu)型的 RNA Kit/總(zong) RNA Kit 不(bu)能有效(xiao)吸附(fu)回(hui)收 miRNA，Trizol 抽提(ti)法也(ye)不能有效(xiao)沈(chen)澱(dian)回(hui)收 miRNA（生物(wu)通(tong)上有專(zhuan)題文章(zhang)闡(chan)述）。
全血(xue)（液(ye)體樣本(ben)）microRNA快速提取(qu)試劑(ji)盒

諾(nuo)博(bo)萊德(de) 全血(xue)（液(ye)體樣本(ben)）microRNA快速提取(qu)試劑(ji)盒

Blood miRNA Mini Kit全血(xue)（液(ye)體樣本(ben)）microRNA 快速提取(qu)試劑(ji)盒

目錄號：91214

產品(pin)內(nei)容

自(zi)備(bei)試劑(ji)

無水乙(yi)醇(chun)

保存條件(jian)

室溫（15 ~ 25℃）

具體產品(pin)的參(can)數(shu)以(yi)收到產品(pin)說(shuo)明(ming)書的參(can)數(shu)為(wei)準(zhun)

產品(pin)簡(jian)介(jie)

常(chang)見的離(li)心柱(zhu)型的 RNA Kit/總(zong) RNA Kit 不(bu)能有效(xiao)吸附(fu)回(hui)收 miRNA，Trizol 抽提(ti)法也(ye)不能有效(xiao)沈(chen)澱(dian)回(hui)收 miRNA（生物(wu)通(tong)上有專(zhuan)題文章(zhang)闡(chan)述）。

裂解液(ye) RLS 是(shi) RNAzol LS Reagent ( 同 Trizo LS ,是濃縮(suo)型(xing)的 Trizol )，配(pei)合(he) miRNA 專用(yong)的溶液(ye)體系，專用(yong)於快(kuai)速提取(qu)全血(xue)、血(xue)漿、血(xue)清(qing)、腦脊液(ye)、尿(niao)液(ye)等(deng)液(ye)體樣本(ben)的 miRNA 和(he)其(qi)它各(ge)種小 RNA(15-30 nt )。

Blood miRNA Mini Kit 可以提(ti)出來包(bao)含(han) miRNA 的總(zong) RNA，用(yong)於miRNA 的 RT、qPCR 檢測(ce)，以及(ji)全轉(zhuan)錄(lu)組測(ce)序(xu)等(deng)；根據需(xu)要(yao)，也(ye)可以壹(yi)次性(xing)把(ba) miRNA 和總 RNA（mRNA、tRNA、rRNA）分別提出來。

產品(pin)特(te)點(dian)

1. 本(ben)公司(si)生產的 Blood miRNA mini Kit 質(zhi)量(liang)優異(yi)，可以媲(pi)美進口(kou)品(pin)牌(pai)。

2. 本(ben)品(pin)可在(zai)常(chang)溫下提(ti)取 RNA，不需(xu)要(yao) 4℃離(li)心機(ji)；亦可以兼(jian)容(rong) 4℃離(li)心機(ji)。

註(zhu)意事項(xiang)

1. Wash Solution 2/3 可能加(jia)入乙醇(chun)使用(yong)幾(ji)天(tian)後，可能會(hui)出現(xian)沈澱(dian)晶(jing)體，並不影響使用(yong)，取(qu)其(qi)上(shang)清直接(jie)使用(yong)就(jiu)可以。

2. 血液(ye) RNA 的常(chang)溫保存(cun)/運(yun)輸/提取的簡(jian)易(yi)方案：

臨(lin)床取(qu)樣：在(zai)臨(lin)床上(shang)，使用(yong)抗(kang)凝管(guan)采(cai)血後，取(qu) 250 μl 新(xin)鮮血液(ye)，加(jia)入 750μl 的裂(lie)解(jie)液(ye) RLS ( RNAzol LS Reagent，Cat#R012-100)，用(yong)移(yi)液(ye)槍(qiang)反復抽打(da)並(bing)振(zhen)蕩混(hun)勻(yun)，在(zai)室(shi)溫(wen)裂解(jie) 5~10 min，直至血細胞充(chong)分發生裂解(jie)。

保存：經裂(lie)解後的血(xue)液(ye)可在(zai)-20℃下(xia)保(bao)存 1-2 個(ge)月，在(zai)-70℃保(bao)存(cun)半年(nian)。

運(yun)輸：可冰袋 4℃運(yun)輸 1 天(tian)，幹冰-20℃運(yun)輸壹(yi)周(zhou)。

提取：後續(xu) RNA 提取(qu)按 R213（或 R012）的說(shuo)明(ming)書進行。

3. RNA 純(chun)度及(ji)濃度(du)檢測(ce):

血清/血漿的 RNA 含(han)量(liang)特(te)別低，已(yi)經低(di)於分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)測(ce)量的下(xia)限，無法準(zhun)確(que)測量(liang)，因(yin)此(ci)無法通(tong)過(guo)測量 OD 值或者比(bi)值的方(fang)法來判斷(duan)濃(nong)度或者純(chun)度，只能通(tong)過(guo)下遊做 RT-qPCR 來判斷(duan)產量。同時(shi)無細胞的血(xue)清(qing)/血漿中(zhong)的 RNA 主(zhu)要(yao)是(shi)小於 100 nt 的 miRNA，因(yin)此(ci)跑電泳(yong)檢測(ce) RNA 完整(zheng)性並(bing)不(bu)適用(yong)於血(xue)清/血漿 RNA。

操作步(bu)驟(zhou)

第壹(yi)次使(shi)用(yong)前(qian)，先在(zai) Wash Solution 1、Wash Solution 2/3、70%乙(yi)醇(chun)中(zhong)加(jia)入無水乙(yi)醇(chun)，加(jia)入量詳見(jian)瓶上的標(biao)簽(qian)。

1. 每(mei) 250 μl 液(ye)體樣品(pin) (血(xue)清、血漿、腦(nao)脊(ji)液(ye)等(deng))，加(jia)入 750 μl 裂解(jie)液(ye) RLS，用(yong)移(yi)液(ye)器(qi)反復抽打(da)幾(ji)次，然(ran)後劇(ju)烈震蕩(dang) 15 sec，充(chong)分混(hun)勻(yun)。（液(ye)體樣品(pin)和(he)裂解液(ye) RLS 的終(zhong)體積比(bi)總是(shi) 1：3）

註(zhu)意：對於含(han)有高(gao)汙(wu)染(ran)物(wu)樣(yang)品(pin)（如(ru)全血(xue)樣(yang)品(pin)），可以用(yong)滅(mie)菌(jun)水按照(zhao) 1：1的比(bi)例(li)稀釋壹(yi)倍後開(kai)始(shi)提取。

2. 將(jiang)勻(yun)漿樣(yang)品(pin)在(zai)室(shi)溫(wen)下放置 5 min，使得(de)核(he)酸蛋(dan)白(bai)復合(he)物完quan分離。

3. 加(jia)入 200 μl 氯仿，劇烈振蕩(dang) 15 秒，並(bing)在(zai)室(shi)溫(wen)下放置 2 分鐘。

4. 於 4℃（或室溫）13，000 rpm 離心 10 分鐘。 樣品(pin)會(hui)分成三層：下(xia)層(ceng)有機(ji)相(xiang)、中(zhong)間(jian)層、上(shang)層無色的水相(xiang)，RNA 存在(zai)於水相(xiang)中(zhong)。水相(xiang)層的容(rong)量(liang)大(da)約(yue)為(wei)所(suo)加(jia)裂解(jie)液(ye) RLS 體積的 70%。

5. 轉移(yi)上清（約 500 μl）至壹(yi)個(ge)新(xin)的離(li)心管(guan)中(zhong)，加(jia)入 1.5 倍體積（750 μl）的無水乙(yi)醇(chun)，吹(chui)打(da)混(hun)勻(yun)。

6. 每(mei)次轉(zhuan)移(yi)≤750 μl上清混(hun)合(he)液(ye)至(zhi)RNA吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)，12,000 rpm離心1 min，倒(dao)棄(qi)濾(lv)液(ye)。重復(fu)此(ci)過(guo)程，直到上(shang)清(qing)混(hun)合(he)液(ye)全部(bu)上(shang)柱。

7. 向 RNA 吸附(fu)柱(zhu)內加(jia)入 700 μl Wash Solution 1（檢查(zha)是否已(yi)加(jia)入乙醇(chun)），12,000 rpm 離心 1 min，倒(dao)棄(qi)濾(lv)液(ye)。

8. 向 RNA吸附(fu)柱(zhu)內加(jia)入 500 μl Wash Solution 2/3（檢查(zha)是否已(yi)加(jia)入乙醇(chun)），12,000 rpm離心1 min，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

9. 重復(fu)步(bu)驟(zhou) 8 壹(yi)次。

10. 將(jiang) RNA 吸附(fu)柱(zhu)放回(hui)空收集管(guan)中(zhong)，12,000 rpm 離心 2min，除(chu)去膜上殘(can)留的乙(yi)醇(chun)。

11. 取出 RNA 吸附(fu)柱(zhu)，放入壹(yi)個(ge)新(xin)的 RNase-Free 1.5 ml 離(li)心管(guan)中(zhong)，向吸附(fu)膜的中(zhong)央部位懸空滴(di)加(jia) 30~50 μl RNase-Free ddH2O，室溫(wen)放置 1 min，12,000 rpm 離心 1 min，管(guan)底即(ji)包(bao)含(han) microRNA 的總(zong) RNA。

附(fu)：microRNA 富(fu)集方(fang)法（僅(jin)僅提取 microRNA，不包(bao)含(han)>200 nt 其(qi)它(ta)總

RNA 成份(fen)。壹(yi)般不(bu)推(tui)薦）

註(zhu)意：當非特(te)異(yi)擴(kuo)增(zeng)較(jiao)多或者擴增背(bei)景(jing)較(jiao)高(gao)時(shi)，可以嘗(chang)試使(shi)用(yong)富(fu)集(ji)方(fang)法提(ti)取的 microRNA。

1. 按照(zhao)前(qian)面標準(zhun)操作(zuo)步(bu)驟(zhou) 1－4 操(cao)作(zuo)，直到得(de)到上(shang)清(qing)。

2. 取上清（約(yue) 500 μl）至(zhi)壹(yi)個(ge)新(xin)的離(li)心管(guan)，加(jia)入等(deng)體積 70％乙醇(chun)（必(bi)須是(shi)

室溫的），吹(chui)打(da)混(hun)勻(yun)，不(bu)要(yao)離(li)心。

3. 取700 μl上清混(hun)合(he)液(ye)，加(jia)入壹(yi)個(ge)RNA吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)，12,000 rpm離心1 min，收集濾(lv)液(ye)。並(bing)將(jiang)濾(lv)液(ye)轉(zhuan)移(yi)至壹(yi)個(ge)新(xin)的離(li)心管(guan)，然(ran)後把(ba) RNA 吸附(fu)柱(zhu)放回(hui)空的收集管(guan)內，再加(jia)入剩下(xia)的混(hun)合(he)物，離心，收集濾(lv)液(ye)。

此(ci)時(shi)，濾(lv)液(ye)含(han)有 microRNA, RNA 吸附(fu)柱(zhu)的膜上是去(qu)除(chu)了 microRNA 的總(zong)RNA（mRNA、tRNA、rRNA 等(deng)大(da)於 200nt 的 RNA），如果有需(xu)要(yao)，可以按照(zhao)前(qian)面標準(zhun)操作(zuo)步(bu)驟(zhou) 7－11 操(cao)作(zuo)，漂洗(xi)、洗脫(tuo)，得(de)到去(qu)除(chu)了 microRNA 的總(zong) RNA。

4. 較精確(que)估(gu)計(ji)濾(lv)液(ye)體積，加(jia)入 0.65 倍體積無水乙(yi)醇(chun)（必(bi)須是(shi)室溫(wen)的），吹(chui)打(da)混(hun)勻(yun)，不(bu)要(yao)離(li)心。

5. 將(jiang)≤750 μl濾(lv)液(ye)混(hun)合(he)物加(jia)入microRNA吸附(fu)柱(zhu)中(zhong)，12,000 rpm離心1min，micoRNA 被吸附(fu)在(zai)膜上，倒棄(qi)廢液(ye)。重復(fu)此(ci)過(guo)程，直到所(suo)有溶液(ye)都上(shang)柱(zhu)。

6. 按照(zhao)前(qian)面標準(zhun)操作(zuo)步(bu)驟(zhou) 7－11 操(cao)作(zuo)，經漂洗(xi)，洗脫(tuo)後，得(de)到富(fu)集(ji)的microRNA。

相(xiang)關產品(pin)：

71418-25 Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit（加(jia)尾(wei)法）

71419-500 Script III miRNA Real-Time PCR Assay kit（for qPCR，加(jia)尾(wei)法）

71613-500 Script III miRNA RT-qPCR Detection kit（P418-25 + P419-500）

全血(xue)（液(ye)體樣本(ben)）microRNA快速提取(qu)試劑(ji)盒