PAX Blood miRNA Kit設計用(yong)於從儲(chu)存(cun)在(zai)保(bao)存(cun)試(shi)劑和(he)PAXgene®中(zhong)的(de)血液(ye)樣品中分(fen)離總(zong)RNA>18個(ge)核(he)苷酸（包括(kuo)miRNA）;血液(ye) RNA 管(guan)。該(gai)程(cheng)序(xu)可wan全去除汙染物(wu)和(he)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)，從而產(chan)生(sheng)高質(zhi)量(liang)的(de) RNA。使(shi)用(yong) PAX Blood miRNA 試(shi)劑盒(he)純化的 RNA 可直(zhi)接(jie)用(yong)於 RT-PCR 等(deng)應用(yong)。
PAX Blood microRNA Kit 核(he)酸提(ti)取

諾博(bo)萊(lai)德(de) PAX Blood microRNA Kit 核(he)酸提(ti)取

PAX Blood miRNA Kit (For PAXgene Blood RNA Tube) 

目錄號：91511

產(chan)品簡介(jie)

PAX Blood miRNA Kit設計(ji)用(yong)於從儲(chu)存(cun)在(zai)保(bao)存(cun)試(shi)劑和(he)PAXgene®中(zhong)的(de)血液(ye)樣品中分(fen)離總(zong)RNA>18個(ge)核(he)苷酸（包括(kuo)miRNA）;血液(ye) RNA 管(guan)。該(gai)程(cheng)序(xu)可wan全去除汙染物(wu)和(he)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)，從而產(chan)生(sheng)高質(zhi)量(liang)的(de) RNA。使(shi)用(yong) PAX Blood miRNA 試(shi)劑盒(he)純化的 RNA 可直(zhi)接(jie)用(yong)於 RT-PCR 等(deng)應用(yong)。

從保(bao)存(cun)試(shi)劑中(zhong)取出樣品。對於(yu)儲存(cun)在(zai) PAXgene 中(zhong)的血液(ye)樣本®血(xue)液(ye) RNA 管(guan)，通(tong)過(guo)離心(xin)收(shou)集(ji)細(xi)胞。樣品在(zai)含有蛋(dan)白酶(mei) K 的優化緩沖(chong)液(ye)下(xia)洗(xi)滌(di)和(he)裂解。將(jiang)樣品離心(xin)以去除細(xi)胞碎(sui)片和(he)其(qi)他(ta)顆粒(li)。用(yong)異(yi)丙醇調整結合條(tiao)件後，將(jiang)樣品上樣到(dao) RNA 結合柱(zhu)上(shang)。通過(guo)短暫(zan)的離心(xin)或(huo)真空步(bu)驟(zhou)，樣品通過(guo)結合 RNA/miRNA 的(de)柱(zhu)基質。經(jing)過(guo)三個(ge)洗(xi)滌(di)步(bu)驟(zhou)後(hou)，用(yong)不含 RNase 的水洗(xi)脫(tuo)純(chun)化的 RNA/miRNA。

具體產(chan)品的參(can)數以(yi)收(shou)到(dao)產(chan)品說明(ming)書的參(can)數(shu)為(wei)準(zhun)

產(chan)品特點

配套(tao)PAXgene采(cai)血/RNA保(bao)存(cun)管(guan)提(ti)取血(xue)液(ye)microRNA

Kit Contents and Storage

註意(yi)：蛋(dan)白酶(mei) K 是(shi)壹(yi)種凍(dong)幹物。離心幾(ji)秒鐘，然(ran)後用(yong) 1 ml 蒸餾水(shui)等(deng)分溶液(ye)復(fu)溶。在(zai) –20 °C 下(xia)儲(chu)存(cun)。 避(bi)免(mian)反復凍(dong)融(rong)。所有試(shi)劑在(zai)指(zhi)ding溫(wen)度(du)下(xia)儲(chu)存(cun)時(shi)，可穩定保(bao)存(cun) 9 個(ge)月(yue)。

描(miao)述
PAX Blood miRNA Kit設計(ji)用(yong)於從儲(chu)存(cun)在(zai)保(bao)存(cun)試(shi)劑和(he)PAXgene® Blood RNA Tube中(zhong)的(de)血液(ye)樣本中(zhong)分(fen)離總(zong)RNA>18個(ge)核(he)苷酸（包括(kuo)miRNA）。該程(cheng)序(xu)可wan全去除汙染物(wu)和(he)酶(mei)抑(yi)制劑(ji)，從而產(chan)生(sheng)高質(zhi)量(liang)的(de) RNA。使(shi)用(yong) PAX Blood miRNA 試(shi)劑盒(he)純化的 RNA 可直(zhi)接(jie)用(yong)於 RT-PCR 等(deng)應用(yong)。

從保(bao)存(cun)試(shi)劑中(zhong)取出樣品。對於(yu)儲存(cun)在(zai) PAXgene® Blood RNA Tubes 中(zhong)的血液(ye)樣本，通(tong)過(guo)離心(xin)收(shou)集(ji)細(xi)胞。樣品在(zai)含有蛋(dan)白酶(mei) K 的優化緩沖(chong)液(ye)下(xia)洗(xi)滌(di)和(he)裂解。將(jiang)樣品離心(xin)以去除細(xi)胞碎(sui)片和(he)其(qi)他(ta)顆粒(li)。用(yong)異(yi)丙醇調整結合條(tiao)件後，將(jiang)樣品上樣到(dao) RNA 結合柱(zhu)上(shang)。通過(guo)短暫(zan)的離心(xin)或(huo)真空步(bu)驟(zhou)，樣品通過(guo)結合 RNA/miRNA 的(de)柱(zhu)基質。經(jing)過(guo)三個(ge)洗(xi)滌(di)步(bu)驟(zhou)後(hou)，用(yong)不含 RNase 的水洗(xi)脫(tuo)純(chun)化的 RNA/miRNA。

用(yong)戶提(ti)供(gong)的材料和(he)設(she)備：

1. 微量(liang)離心(xin)機(ji)的(de)離(li)心能(neng)力為(wei) 13,000 x g

2. 100% 異(yi)丙醇

3. 不含 RNase 的過(guo)濾移(yi)液(ye)器吸(xi)頭

4. 不含 RNase 的水

5. 1.5 或 2.0 ml 微(wei)量離(li)心(xin)管(guan)

6. 搖(yao)動(dong)培養(yang)箱或加熱(re)塊(kuai)，溫(wen)度(du)可達 55°C、65°C

7. 帶水平(ping)轉子(zi)的(de)離(li)心機(ji)，離(li)心(xin)力可達 5,500 x g

註意(yi)：
     shou次使(shi)用(yong)前(qian)，將(jiang)規(gui)定量(liang)的乙(yi)醇加入洗(xi)滌(di)液(ye)中(zhong)

溶液(ye) 1 和(he)洗(xi)滌(di)溶液(ye) 2/3 瓶(ping)，充分混(hun)合，並用(yong)勾號標記瓶子(zi)。

將(jiang)培養(yang)箱或加熱(re)塊(kuai)加熱(re)至(zhi) 55°C。

1. 使用(yong)水平(ping)轉子(zi)以(yi) 3,000-5,000 x g 的(de)離心(xin)力離(li)心(xin) PAXgene® Blood RNA 管 10 分鐘(zhong)。

2. 吸(xi)出並丟(diu)棄上清(qing)液(ye)。
     3. 加入 4 mL 不含 RNase 的水。渦(wo)旋(xuan)以wan全重(zhong)懸(xuan)沈澱(dian)。
     4. 使用(yong)水平(ping)轉子(zi)以(yi) 3,000-5,000 x g 的(de)離心(xin)力離(li)心(xin) PAXgene® Blood RNA Tube 10 分鐘。
     5. 吸(xi)出並丟(diu)棄上清(qing)液(ye)。

註意(yi)：不wan全去除上清(qing)液(ye)會(hui)降(jiang)低裂解效(xiao)率並稀釋裂解物(wu)，從而降(jiang)低 RNA 產(chan)量(liang)。

6. 加入 350 μl 重(zhong)懸(xuan)緩(huan)沖(chong)液(ye)。渦(wo)旋(xuan)以wan全重(zhong)懸(xuan)沈澱(dian)。
     7. 將(jiang)樣品轉移(yi)到(dao)新的(de) 1.5 ml 微量(liang)離心管中(zhong)。
     8. 加入 300 μL 結合緩(huan)沖(chong)液(ye)和(he) 20 μL 蛋(dan)白酶(mei) K 溶液(ye)。渦(wo)旋(xuan) 5 秒鐘以(yi)充分混(hun)合。

9. 使用(yong)振(zhen)蕩培養(yang)箱在(zai) 55°C 下(xia)孵(fu)育 10 分鐘(zhong)。
    10. 可選(xuan)：將(jiang)裂解物(wu)通過(guo)安(an)裝(zhuang)在(zai)註(zhu)射器上(shang)的(de) 20 號針頭(tou)（直(zhi)徑(jing) 0.9 mm）至少 5 次，或(huo)使用(yong)電子(zi)組織(zhi)勻漿器勻漿。此步驟(zhou)剪(jian)切(qie)基因組 DNA，降(jiang)低裂解物(wu)的粘(zhan)度(du)，並提(ti)高產(chan)量(liang)。

11. 將(jiang)勻漿以 13,000 rpm 離(li)心 3 min。將(jiang)上(shang)清(qing)液(ye)轉移(yi)到(dao)新的(de)離心(xin)管中。
     12. 加入等(deng)體積的(de) 100% 異(yi)丙醇。渦(wo)旋(xuan)充分混(hun)合。
     13. 將(jiang)最(zui)多(duo) 700 μl 混(hun)合物(wu)轉移(yi)至(zhi) 2 ml 收(shou)集(ji)管（提(ti)供(gong)）中的(de) RNA 結合柱(zhu)中(zhong)。

14. 以最(zui)大速(su)度離(li)心 1 分(fen)鐘。
     15. 吸(xi)出並丟(diu)棄濾液(ye)，重(zhong)復(fu)使(shi)用(yong)收(shou)集(ji)管。
     16.重復(fu)步驟(zhou) 13-15，直(zhi)到(dao)剩余(yu)樣品轉移(yi)到(dao) RNA 結合柱(zhu)中(zhong)。

17. 加入 350 μl 洗(xi)滌(di)液(ye) 1.
     18. 以最(zui)大速(su)度離(li)心 1 分(fen)鐘。
     19. 吸(xi)出並丟(diu)棄濾液(ye)，重(zhong)復(fu)使(shi)用(yong)收(shou)集(ji)管。
     20. 對於(yu)每個(ge) RNA 結合柱(zhu)，準(zhun)備 DNase I 消(xiao)化

反應混(hun)合物(wu)如(ru)下(xia)：

重要(yao)說明(ming)：
     • DNase I 非常(chang)敏感，容(rong)易(yi)發生(sheng)物理變(bian)性(xing)。不要渦(wo)旋(xuan) DNase I 混(hun)合物(wu)。倒置(zhi)試(shi)管輕(qing)輕(qing)混(hun)勻。
     • 在(zai) RNA 分(fen)離之前(qian)新(xin)鮮(xian)制備 DNase I 儲(chu)備液(ye)。
     • 標準(zhun) DNase 緩沖(chong)液(ye)與(yu)膜上(shang) DNase I 消化不兼容。使用(yong)其他(ta)緩沖(chong)液(ye)可能(neng)會影響(xiang) RNA 與(yu)基質的結合，並可能(neng)降(jiang)低 RNA 產(chan)量(liang)和(he)純(chun)度(du)。

• 所有步(bu)驟(zhou)必須在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)進行。快(kuai)速(su)但小(xiao)心(xin)地(di)工(gong)作。

21. 將(jiang) 50 μl DNase I 消(xiao)化反應混(hun)合物(wu)直(zhi)接(jie)移(yi)液(ye)到(dao) RNA 結合柱(zhu)的(de)中心表面(mian)。

註意(yi)：確保(bao)將(jiang) DNase I 消(xiao)化混(hun)合物(wu)直(zhi)接(jie)移(yi)液(ye)到(dao)膜上(shang)。如(ru)果(guo)壹(yi)些混(hun)合物(wu)保(bao)留在(zai) RNA 結合柱(zhu)的(de)壁或 O 形圈(quan)上(shang)，則(ze) DNase I 消(xiao)化將(jiang)不wan全

22. 在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)靜(jing)置 15 分(fen)鐘。
    23. 加入 350 μl 洗(xi)滌(di)液(ye) 1.以(yi)最(zui)大(da)速(su)度離(li)心 1 分(fen)鐘。
    24. 吸(xi)出並丟(diu)棄濾液(ye)，重(zhong)復(fu)使(shi)用(yong)收(shou)集(ji)管。
    25. 加入 500 μl 洗(xi)滌(di)液(ye) 2/3。以(yi)最(zui)大(da)速(su)度離(li)心 1 分(fen)鐘。
    26. 吸(xi)出並丟(diu)棄濾液(ye)，重(zhong)復(fu)使(shi)用(yong)收(shou)集(ji)管。
    27. 重復(fu)步驟(zhou) 25-26 進行第二(er)個(ge)洗(xi)滌(di)液(ye) 2/3 洗(xi)滌(di)步(bu)驟(zhou)。

28. 以最(zui)大速(su)度離(li)心空的(de) RNA 結合柱(zhu) 2 分(fen)鐘，以幹燥柱(zhu)基質。

註意(yi)：洗脫(tuo)前(qian)幹燥柱(zhu)膜(mo)很重(zhong)要(yao)。
殘留的(de)乙(yi)醇可能(neng)會幹擾下(xia)遊(you)應(ying)用(yong)。

29. 將(jiang) RNA 結合柱(zhu)轉移(yi)到(dao) 1.5 mL 微量(liang)離心(xin)管中。
     30. 將(jiang) 50-70 μl 不含 RNase 的水直(zhi)接(jie)加入到(dao)膜中(zhong)心（可選(xuan)：將(jiang)水(shui)預熱(re)至(zhi) 70–90°C 將(jiang)增加 RNA 產(chan)量(liang)）。在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)靜(jing)置 1 分(fen)鐘。
     31. 以最(zui)大速(su)度離(li)心 2 分(fen)鐘。

 PAX Blood microRNA Kit 核(he)酸提(ti)取