FlashPure Bacteria miRNA Mini Kit 是專用於(yu)提(ti)取(qu)各(ge)種(zhong)植(zhi)物(wu)組織的miRNA（包含 miRNA 的(de)總(zong) RNA），是(shi)通(tong)用(yong)型 microRNA 快速提(ti)取(qu)試(shi)劑盒（Cat#91015）的升級(ji)版，提(ti)取(qu)過程(cheng)不再(zai)需(xu)要使(shi)用(yong)氯(lv)仿，並(bing)采用(yong)獨(du)you的(de) gDNA 過濾(lv)器(qi)，高(gao)效(xiao)濾(lv)除基(ji)因組，得(de)到(dao)包(bao)含(han) miRNA 的(de)總 RNA
細菌(jun)microRNA快速(su)提(ti)取(qu)試(shi)劑盒

諾(nuo)博萊德(de) 細菌(jun)microRNA快速(su)提(ti)取(qu)試(shi)劑盒

FlashPure Bacteria miRNA Mini Kit細菌(jun) microRNA 快速(su)提(ti)取(qu)試(shi)劑盒（免氯(lv)仿）

目錄號：91613

產品內容

自(zi)備(bei)試(shi)劑

無水乙醇

保(bao)存條件

rong菌(jun)酶，常溫(wen)運輸(shu)， 4℃保(bao)存；其(qi)他組分，室(shi)溫(wen)（15 ~ 25℃）保(bao)存。

具體產品的參(can)數以(yi)收(shou)到(dao)產品說明(ming)書(shu)的參(can)數為(wei)準

具體產品的參(can)數以(yi)收(shou)到(dao)產品說明(ming)書(shu)的參(can)數為(wei)準

產品簡(jian)介(jie)

市場上(shang)常(chang)見的離(li)心(xin)柱型的 RNA Kit/總 RNA Kit，不能(neng)有效(xiao)吸附(fu)回(hui)收(shou)miRNA；Trizol 沈澱(dian)抽提(ti)法(fa)也(ye)不能(neng)有效(xiao)沈澱(dian)回(hui)收(shou)全(quan)部 miRNA（生(sheng)物(wu)通(tong)上(shang)有(you)專題文(wen)章(zhang)闡述）。

FlashPure Bacteria miRNA Mini Kit 是(shi)專用於(yu)提(ti)取(qu)各(ge)種(zhong)植(zhi)物(wu)組織的miRNA（包含 miRNA 的(de)總(zong) RNA），是(shi)通(tong)用(yong)型 microRNA 快速提(ti)取(qu)試(shi)劑盒（Cat#91015）的升級(ji)版，提(ti)取(qu)過程(cheng)不再(zai)需(xu)要使(shi)用(yong)氯(lv)仿，並(bing)采用(yong)獨(du)you的(de) gDNA 過濾(lv)器(qi)，高(gao)效(xiao)濾(lv)除基(ji)因組，得(de)到(dao)包(bao)含(han) miRNA 的(de)總 RNA，可直(zhi)接(jie)用於(yu) miRNA和 mRNA 的(de) RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、芯片(pian)、測序(xu)等(deng)。

註(zhu)意(yi)事項(xiang)

1. 樣(yang)品應(ying)避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)，否(fou)則會影響 RNA 的提(ti)取(qu)得(de)率(lv)和質量(liang)。

2. 樣(yang)品加(jia)入(ru)裂(lie)解(jie)液(ye) BRL Plus 勻漿(jiang)後，樣(yang)品可在–80℃保(bao)存壹個(ge)月(yue)以(yi)上(shang)。

重要(yao)提(ti)示(shi)：

① 第(di)壹次使(shi)用(yong)前(qian), 請先在(zai) Wash Solution 1、Wash Solution 2/3 中加(jia)入(ru)指(zhi)ding量(liang)無水乙醇，詳(xiang)見瓶(ping)身(shen)的(de)標(biao)簽(qian)。

② 每次操(cao)作(zuo)前(qian)，請(qing)先(xian)配制添加(jia)了(le)rong菌(jun)酶或者(zhe) Lysostaphin 的(de) TE (PH 8.0)，終(zhong)濃度(du)為(wei) 1mg/ml。

③ 所有(you)離(li)心(xin)步(bu)驟(zhou)均需(xu)要在(zai)室(shi)溫(wen)（15~37℃）下進(jin)行，提(ti)取(qu)效(xiao)果更(geng)佳！

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)（可得(de)到(dao)包(bao)含(han) miRNA 的(de)總 RNA）

1. 離(li)心(xin)收集(ji) 1 ~ 2 ml 菌(jun)液(ye)（108 ~ 109細胞(bao)）到壹個(ge) 1.5 ml 離(li)心(xin)管, 盡可能(neng)徹di吸(xi)棄(qi)上(shang)清(qing)。

2. 根(gen)據(ju)細(xi)胞(bao)的種類(lei)和數(shu)量(liang)，充(chong)分重(zhong)懸細(xi)胞(bao)在 100 μl（5x108細胞(bao)）/ 200 μl（5x108 ~7.5x108 細胞(bao)）TE 中（確保(bao)已添加(jia)rong菌(jun)酶或者(zhe) Lysostaphin 至(zhi)TE 中，濃度(du)為(wei) 1mg/ml )，或者(zhe)直(zhi)接(jie)用 TE 重懸後(hou)，用(yong)幹(gan)凈(jing)槍頭挑取(qu)少許(xu)rong菌(jun)酶加(jia)入(ru)。

3. 室(shi)溫(wen)(15~25℃)溫(wen)育5min/rong菌(jun)酶, 或者(zhe)37℃溫(wen)育15min / Lysostaphin，破(po)解(jie)細(xi)胞(bao)壁。每 2 min 渦旋(xuan)振蕩(dang) 10 sec，幫(bang)助破(po)壁(bi)。

註(zhu)意：各(ge)種(zhong)細菌(jun)破(po)壁(bi)的(de)難(nan)易程(cheng)度(du)不壹樣(yang)，壹般革(ge)蘭氏(shi)陰(yin)性菌(jun) E.coli 使用(yong)上(shang)面(mian)的(de)條件就足夠了(le)，,甚(shen)至(zhi)可能(neng)省(sheng)略該(gai)步(bu)驟(zhou)，但是某些(xie)革(ge)蘭氏(shi)陽性菌(jun)如B. subtilis 難(nan)破(po)壁(bi)需(xu)要提(ti)高(gao)rong菌(jun)酶濃度(du)到 15mg/ml 和溫(wen)育時(shi)間(jian)到(dao)10min。如果金黃(huang)色(se)葡萄qiou菌(jun)需(xu)要加(jia)入(ru) lysostaphin 到(dao) 1mg/ml，37℃溫(wen)育 15min。總(zong)之不同細(xi)菌(jun)類(lei)型破(po)壁(bi)難(nan)易程(cheng)度(du)不同，有(you)的難(nan)破(po)壁(bi)的(de)種(zhong)類(lei)

需(xu)要根(gen)據(ju)用(yong)戶(hu)自(zi)己(ji)的(de)具體情(qing)況(kuang)調節酶的種類(lei)、工(gong)作(zuo)濃度(du)和溫(wen)育溫(wen)度(du)、時間(jian)，此(ci)外還可以(yi)聯合使(shi)用玻璃珠(zhu)擊(ji)打，機(ji)械破(po)壁(bi)，蛋白(bai)酶 K 消化(hua)等(deng)方(fang)法幫(bang)助破(po)壁(bi)。

4. 短暫離(li)心(xin)收集(ji)細菌(jun)，徹di吸(xi)棄(qi)上(shang)清(qing)後，加(jia)入(ru) 500 μl 裂(lie)解(jie)液(ye) BRL Plus，渦旋(xuan)震蕩(dang)或(huo)者(zhe)吹(chui)打(da)混(hun)勻，裂解細(xi)菌(jun)。

5. 物(wu)將裂解(jie)勻漿(jiang)液(ye)全部加(jia)到(dao) gDNA 過濾(lv)器(qi)中（過濾(lv)器(qi)放(fang)入收集管(guan)中），13,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，保(bao)留濾(lv)液(ye)，（RNA/microRNA 在濾(lv)液(ye)中）。

6. 用(yong)移(yi)液(ye)器(qi)較(jiao)精(jing)確估計(ji)濾(lv)液(ye)體積(ji)（壹般 480 μl），向濾(lv)液(ye)中加(jia)入(ru) 1.25 倍(bei)體(ti)積(ji)(壹般 600μl )的(de)無水乙醇，吹(chui)打(da)混(hun)勻。

7. 每次轉(zhuan)移(yi)≤750 μl濾(lv)液(ye)混(hun)合物(wu)至(zhi)RNA吸(xi)附(fu)柱中，13,000 rpm離(li)心(xin)1min，此(ci)時，RNA 被吸附(fu)在(zai)膜(mo)上(shang)，棄(qi)濾(lv)液(ye)。重復(fu)此(ci)過程(cheng)，直(zhi)到(dao)溶(rong)液(ye)全部上(shang)柱。

8. 加(jia)入(ru) 700 μl Wash Solution 1（檢(jian)查是否(fou)已加(jia)入(ru)乙(yi)醇），室(shi)溫(wen)放置(zhi) 1 min,13,000 rpm 離(li)心(xin) 30 sec，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

9. 加(jia)入(ru) 500 μl Wash Solution 2/3（檢(jian)查是否(fou)已加(jia)入(ru)乙(yi)醇），13,000 rpm離(li)心(xin) 30 sec，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

10. 重復(fu)步(bu)驟(zhou) 7。

11. 將 RNA 吸附(fu)柱放回(hui)空(kong)收(shou)集管中，13,000 rpm 離(li)心(xin) 2 min，除去膜上(shang)殘(can)留的留乙醇。

12. 取(qu)出(chu) RNA 吸附(fu)柱，放入(ru)壹個(ge) RNase-free 1.5 ml 離(li)心(xin)管中，向吸附(fu)膜(mo)的(de)中央(yang)懸空(kong)滴(di)加(jia) 30-50 μl 的(de) RNase-free H2O，室(shi)溫(wen)放置(zhi) 1 min，13,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，管底(di)即(ji)包(bao)含 miRNA 的總 RNA。

附(fu)錄(lu)：

microRNA 富(fu)集(ji)方(fang)法（僅(jin)僅(jin)提(ti)取(qu) microRNA，不包(bao)含(han)>200 nt 其(qi)它總(zong) RNA成(cheng)份(fen)。壹般不推(tui)薦(jian)）

註(zhu)意(yi)：當非特(te)異擴(kuo)增(zeng)較多或者(zhe)擴(kuo)增(zeng)背(bei)景(jing)較高(gao)時(shi)，可以(yi)嘗(chang)試使(shi)用(yong)富(fu)集方(fang)法提(ti)取(qu)的(de) microRNA。

1. 按照(zhao)前(qian)面(mian)步(bu)驟(zhou) 1、2 操(cao)作(zuo)，直(zhi)到(dao)得(de)到(dao)上(shang)清(qing)。

2. 轉(zhuan)移(yi)上(shang)清(qing)（約 500 μl）至(zhi)壹個(ge)新的離(li)心(xin)管中，加(jia)入(ru) 0.5 倍(bei)體(ti)積(ji)的無(wu)水乙醇（必(bi)須(xu)是室(shi)溫(wen)的），吹(chui)打(da)混(hun)勻。

3. 將混(hun)合液(ye)加(jia)入(ru) gDNA 過濾(lv)器(qi)中，13,000 rpm 離(li)心(xin) 1 min，收集(ji)濾(lv)液(ye) （microRNA 在濾(lv)液(ye)中）。

此(ci)時，RNA吸(xi)附(fu)柱的膜(mo)上(shang)是(shi)去除了(le)microRNA的總(zong)RNA（mRNA、tRNA、rRNA），如果有(you)需(xu)要，可以(yi)按(an)照(zhao)前(qian)面(mian)標(biao)準(zhun)操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou) 6－10 操(cao)作(zuo)，經(jing)漂(piao)洗(xi)、洗(xi)脫(tuo)後，得(de)到(dao)去(qu)除了(le) microRNA 的總(zong) RNA。

4. 較精(jing)確估計(ji)濾(lv)液(ye)體積(ji)，加(jia)入(ru)等(deng)體積(ji)的無(wu)水乙醇（必(bi)須(xu)是室(shi)溫(wen)的），吹(chui)打(da)混(hun)勻，不要(yao)離(li)心(xin)。

5. 每次轉(zhuan)移(yi)≤750 μl濾(lv)液(ye)混(hun)合物(wu)至(zhi)RNA吸(xi)附(fu)柱中，13,000 rpm離(li)心(xin)1 min，micoRNA 被吸附(fu)在(zai)膜(mo)上(shang)，倒(dao)棄(qi)濾(lv)液(ye)。重復(fu)此(ci)過程(cheng)，直(zhi)到(dao)所有(you)濾(lv)液(ye)混(hun)合物(wu)都(dou)上(shang)柱。

6. 按照(zhao)前(qian)面(mian)標(biao)準(zhun)操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou) 6－10，經(jing)漂(piao)洗(xi)、洗(xi)脫(tuo)後，得(de)到(dao) microRNA。

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