諾(nuo)博萊(lai)德(de) 凝(ning)固全血(xue)基(ji)因(yin)組DNA提qu系(xi)統 核(he)酸(suan)提取

凝固(gu)血(xue)液(ye)基因(yin)組DNA提qu試(shi)劑(ji)盒(he)（溶液(ye)型）

目錄號(hao):40311

產(chan)品(pin)內(nei)容：

自備(bei)試(shi)劑(ji)：

異(yi)丙醇、70％乙(yi)醇

保存(cun)條件：

室溫(wen)（15~25℃）

具體(ti)產(chan)品(pin)的(de)參(can)數以(yi)收(shou)到產(chan)品(pin)說明書的參數為準(zhun)

產(chan)品(pin)簡(jian)介(jie)：

適用(yong)於從凝固(gu)血(xue)液(ye)樣本中快(kuai)速(su)提取高(gao)質量(liang)的(de)基因(yin)組DNA。

首先(xian)細胞核(he)裂(lie)解(jie)液(ye)配(pei)合(he)蛋白酶K裂(lie)解(jie)凝固血(xue)kuai釋(shi)放(fang)出(chu)基(ji)因(yin)組DNA， 然(ran)後蛋白沈澱(dian)液(ye)選擇(ze)性沈澱去除(chu)蛋(dan)白，最後純凈的(de)基(ji)因(yin)組DNA在(zai)Sigma的(de)分子(zi)生物學(xue)級Glycogen的(de)助(zhu)沈下(xia)通(tong)過(guo)異(yi)丙醇沈澱(dian)並重溶解(jie)於DNA溶解(jie)液(ye)。

產(chan)品(pin)特(te)點(dian)：

1.  簡(jian)便(bian)快(kuai)速(su)：30min內(nei)可獲(huo)得高(gao)純度(du)的(de)基因(yin)組DNA。

2.    安全無(wu)毒(du)：無(wu)需ben酚/氯仿抽提。

3.    高(gao)產(chan)：典型的(de)產(chan)量1ml全血(xue)可(ke)提取出(chu)10～30µg基因(yin)組DNA。

4. 高(gao)純：OD260/280=1.7～1.9，長度(du)可(ke)達50～150kb，可直接(jie)進行可直接(jie)用於構建(jian)文(wen)庫、PCR、酶切(qie)、Southern-blot 等(deng)分子(zi)生物學(xue)實(shi)驗(yan)。

註(zhu)意(yi)事項(xiang)：

1.   本試(shi)劑(ji)盒(he)可(ke)運用於多(duo)種抗凝劑的(de)全血(xue)，如(ru)EDTA、檸檬(meng)酸、肝(gan)素(su)抗凝血(xue)。其(qi)中由(you)於(yu)肝素(su)抗凝血(xue)的(de)白細胞沈澱團很難(nan)打散(san)重懸(xuan)，影(ying)響(xiang)裂(lie)解(jie)效果，建議選(xuan)用(yong)非(fei)肝素(su)的抗凝劑收(shou)集血(xue)液(ye)標本。

2.    為了(le)優良效guo，最好(hao)使用(yong)新鮮(xian)血(xue)液(ye)標本或(huo)者(zhe)4℃存放(fang)少於(yu)3天的(de)標本，不(bu)要(yao)使用(yong)反復凍融(rong)超過(guo)3次的(de)標(biao)本，否(fou)則會嚴(yan)重(zhong)降(jiang)低產(chan)量。

3.   不(bu)同(tong)樣品(pin)尤(you)其(qi)疾病(bing)樣(yang)品(pin)中(zhong)白細胞數量差異(yi)可(ke)能(neng)非(fei)常(chang)大，血(xue)液(ye)DNA產(chan)量的(de)個體(ti)差異(yi)也可(ke)能(neng)非(fei)常(chang)大。

4.   如果(guo)結合(he)液(ye)CB、抑(yi)制物去除(chu)液(ye)IR有沈澱析出(chu)，可(ke)在(zai)37℃水浴(yu)溶解(jie)，搖勻後使用(yong)。

5.    本試(shi)劑(ji)盒(he)為(wei)溶液(ye)型，可(ke)以(yi)很(hen)容易的按(an)照比(bi)例擴(kuo)大或(huo)者(zhe)縮小(xiao)每次處(chu)理(li)的全血(xue)量（20µl-10ml），請(qing)聯系(xi)我們(men)索取其(qi)它(ta)處(chu)理(li)量的(de)操(cao)作(zuo)手(shou)冊(ce)。

6.    DNA溶解(jie)液(ye)是TE緩(huan)沖液(ye)洗(xi)脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0），長期(qi)保存(cun)DNA，但(dan)是(shi)EDTA可能(neng)下(xia)遊酶切(qie)反(fan)應，使(shi)用(yong)時可以(yi)適(shi)當稀(xi)釋(shi)。也可以(yi)使(shi)用水洗(xi)脫，但(dan)應該(gai)確保(bao)批pH大於7.5，pH過(guo)低影(ying)響(xiang)洗(xi)脫效率。用(yong)水洗(xi)脫DNA應該(gai)保存(cun)在(zai)－20℃。

操(cao)作(zuo)步驟(zhou)：

1. 加入(ru)■50μl凝固(gu)血(xue)液(ye)至壹(yi)個1.5ml離心(xin)管(guan)或(huo)◆1ml凝固(gu)血(xue)液(ye)至壹(yi)個

50ml離心(xin)管(guan)，劇(ju)烈(lie)渦(wo)旋或(huo)者(zhe)用手(shou)劇(ju)烈(lie)拍(pai)打離心(xin)管(guan)幫(bang)助(zhu)打散(san)凝(ning)血(xue)kuai。

2.  加入(ru)■550μl或(huo)◆11ml 細胞核(he)裂(lie)解(jie)液(ye)，吹打混(hun)勻，再加入■3μl或(huo)◆

60μl蛋白酶K(20mg/ml)，顛(dian)倒混(hun)勻25次。

3.  55℃放(fang)置3小(xiao)時至過(guo)夜(ye)，直到所有的(de)凝(ning)塊完(wan)quan融(rong)解。

4.   可選(xuan)步驟(zhou)（壹(yi)般不(bu)需(xu)要(yao)做）：加入(ru)■3μl或(huo)◆60μlRNaseA（4mg/ml），在(zai)裂(lie)解(jie)物中(zhong)加(jia)入(ru)RNaseA（10mg/ml）至終(zhong)濃(nong)度(du)30μg/ml，顛倒25次混(hun)勻，37℃溫育15分鐘去除(chu)殘(can)留RNA。

5.  將(jiang)裂(lie)解(jie)物迅(xun)速(su)冷(leng)卻到室溫(wen)（可(ke)置冰上(shang)壹(yi)分鐘）。

6.  加入(ru)■200μl或(huo)◆4ml蛋白沈澱(dian)液(ye)，在(zai)渦(wo)旋振蕩器上(shang)高(gao)速(su)連續(xu)振蕩混(hun)勻

25秒，混(hun)勻後可能(neng)見到壹(yi)些(xie)小(xiao)的蛋(dan)白團塊。

註(zhu)意(yi)：液(ye)體(ti)確實(shi)要(yao)旋轉著振蕩起(qi)來(lai)，而不(bu)僅(jin)僅(jin)是(shi)上(shang)下(xia)振動，這樣混(hun)勻效果和沈澱(dian)蛋(dan)白效guo優良。

7. 置冰上(shang)■5分鐘或(huo)◆10分鐘。

8.  ■13,000-16,000xg離心(xin)5分鐘或(huo)◆2,500xg(可根(gen)據需(xu)要(yao)調整加大離心(xin)力)離心(xin)10分鐘。這時候(hou)應該(gai)可以(yi)見到管(guan)底(di)暗(an)褐色(se)的(de)蛋(dan)白沈澱(dian)，也可(ke)能(neng)見到壹(yi)些(xie)蛋白沈澱(dian)漂(piao)浮在(zai)液(ye)體(ti)表面。

9.  小(xiao)心(xin)吸(xi)取上(shang)清(qing)到(dao)壹(yi)個新的(de)■1.5ml離心(xin)管(guan)或(huo)◆50ml離心(xin)管(guan)中(zhong)。

註(zhu)意(yi)：吸取上(shang)清(qing)時，註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)吸到管底(di)的(de)和漂(piao)浮在(zai)液(ye)體(ti)表面的蛋白沈澱(dian)。如果(guo)不(bu)小(xiao)心(xin)將(jiang)蛋白沈澱(dian)轉(zhuan)入新的(de)離心(xin)管(guan)中(zhong)，可(ke)再次離心(xin)2分鐘後取上(shang)清(qing)。

10.加入(ru)■600μl的室(shi)溫異(yi)丙醇和1μlGlycogen溶液(ye)或(huo)◆12ml室溫(wen)異(yi)丙醇和20μlGlycogen溶液(ye)，輕(qing)柔(rou)顛(dian)倒50次混(hun)勻或(huo)者(zhe)直到出(chu)現棉絮(xu)狀（絲狀）白色DNA沈澱(dian)。（註(zhu)意(yi)：處理(li)樣品(pin)量(liang)大的時候(hou)才(cai)可(ke)能(neng)看見絲狀沈澱(dian)，處理(li)樣品(pin)量(liang)少(shao)或(huo)者(zhe)保存(cun)質量(liang)不(bu)好(hao)的時候(hou)往(wang)往(wang)看不(bu)見。）

11. ■13,000-16,000xg離心(xin)1分鐘或(huo)◆2,500xg離心(xin)3分鐘，這時候(hou)應該(gai)看到管底(di)白色的(de)DNA沈(chen)澱。

12. 小(xiao)心(xin)棄(qi)上(shang)清(qing)，倒置後在(zai)吸(xi)水紙(zhi)上(shang)輕(qing)敲(qiao)幾下以(yi)控幹(gan)殘留乙(yi)醇（註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)丟(diu)失(shi)沈澱(dian)）。

13.加入(ru)■600μl或(huo)◆12ml70%乙(yi)醇，顛倒幾次漂(piao)洗(xi)DNA沈澱(dian)。

14. ■13,000-16,000xg離心(xin)1分鐘或(huo)◆2,500xg離心(xin)1分鐘,倒去上(shang)清(qing)（沈澱(dian)很松(song)，註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)把DNA沈澱(dian)倒掉了(le)），倒置後在(zai)吸(xi)水紙(zhi)上(shang)輕(qing)敲(qiao)幾下以(yi)控幹(gan)殘留乙(yi)醇，還(hai)可(ke)以(yi)用(yong)槍(qiang)頭小(xiao)心(xin)吸(xi)掉(diao)管(guan)底(di)沈(chen)澱周(zhou)圍和(he)管(guan)壁(bi)的(de)殘(can)留乙(yi)醇，空氣(qi)晾(liang)幹(gan)沈澱(dian)幾分鐘。

註(zhu)意(yi)：不(bu)要(yao)幹(gan)燥過(guo)頭，否(fou)則DNA極(ji)其(qi)難溶；也不(bu)能(neng)殘(can)留太(tai)多(duo)乙(yi)醇，否(fou)則乙(yi)醇可能(neng)抑(yi)制下遊如(ru)酶切(qie)反(fan)應。

15.加入(ru)■20μl或(huo)◆250-400μl TE 緩(huan)沖液(ye)(或(huo)者(zhe)客戶(hu)根(gen)據(ju)需要(yao)選擇(ze)的緩(huan)沖液(ye))重新(xin)水化(hua)溶解(jie)DNA 沈澱(dian)，輕(qing)彈(dan)管(guan)壁(bi)混(hun)勻，可以(yi)放(fang)置在(zai) 65℃溫(wen)育 30-60分鐘（不(bu)要(yao)超過(guo)壹(yi)小(xiao)時），也可(ke)以(yi)在(zai)室(shi)溫或(huo)者(zhe) 4℃放(fang)置過(guo)夜(ye)來(lai)重新(xin)水化(hua) DNA，中(zhong)間(jian)不(bu)時的輕(qing)彈(dan)管(guan)壁(bi)幫(bang)助(zhu)重新(xin)水化(hua) DNA。

16. DNA 可以(yi)存(cun)放(fang)在(zai) 2-8℃,如(ru)果要(yao)長時間存(cun)放(fang)，可以(yi)放(fang)置在(zai)－20℃。

相(xiang)關產(chan)品(pin)：

50111-500 10000x GenRed（同GelRed）  無(wu)毒(du)核(he)酸(suan)染料(liao) 凝(ning)膠(jiao)成像(xiang)儀(yi)用

71800-05 2x Lightning Taq PCR MasterMix（含染料(liao)） 延(yan)伸速(su)度：6 kb/min

71517-05  2x KOD PCR MasterMix（含染料(liao)）  擴(kuo)增(zeng)長度(du)≤6kb  6 kb/min

凝固(gu)全血(xue)基(ji)因(yin)組DNA提qu系(xi)統 核(he)酸(suan)提取