該試(shi)劑盒(he)采用(yong)DNA吸附柱和獨you的溶(rong)液(ye)系(xi)統(tong)，適合於從(cong)多(duo)種(zhong)來源(yuan)的酵母培(pei)養(yang)物中(zhong)快(kuai)速簡(jian)單地提取(qu)基因組(zu)DNA。約3ml處(chu)於指數生(sheng)長(chang)期的酵母培(pei)養(yang)液(ye)壹般壹(yi)次(ci)抽(chou)提可純化(hua)出10-15μg的高質(zhi)量(liang)的基因組(zu)DNA。
酵母基因組(zu)DNA快(kuai)速提(ti)qu試(shi)劑盒(he) 核酸(suan)提取

諾博萊德 酵母基因組(zu)DNA快(kuai)速提(ti)qu試(shi)劑盒(he) 核酸(suan)提取

酵母基因組(zu)DNA快(kuai)速提(ti)取試(shi)劑盒(he)(離心柱型)

目錄號(hao)：40210

v 適用(yong)範圍：

適用(yong)於快(kuai)速提(ti)取各種(zhong)酵母基因組(zu)DNA

v 試(shi)劑盒(he)組(zu)成、儲存、穩定(ding)性：

本(ben)試(shi)劑盒(he)在(zai)室(shi)溫(wen)儲(chu)存12個月不影響(xiang)使(shi)用(yong)效果(guo)。

具體(ti)產(chan)品的參數以(yi)收(shou)到產(chan)品說(shuo)明書(shu)的參數為(wei)準

儲存事(shi)項:

1.   結(jie)合(he)液(ye)CB或者抑(yi)制(zhi)物去除液(ye)IR低溫時可能出(chu)現析(xi)出(chu)和沈澱(dian)，可以在(zai)37℃水(shui)浴(yu)幾分鐘幫(bang)助(zhu)重新(xin)溶(rong)解(jie)，恢(hui)復澄清透(tou)明後冷(leng)卻(que)到室(shi)溫(wen)即(ji)可使用(yong)。

2.   為避(bi)免降低活性，方(fang)便運(yun)輸，提供(gong)蛋(dan)白(bai)酶K為(wei)凍(dong)幹(gan)粉狀（20mg），收(shou)到後(hou)，可短暫(zan)離(li)心後(hou)，加(jia)入1毫(hao)升(sheng)滅菌(jun)水溶解配制(zhi)成20mg/ml溶液(ye)，因為反復凍(dong)融(rong)可能會降低酶活(huo)性，因此溶解後(hou)立(li)即(ji)按(an)照(zhao)每次使用(yong)量分裝凍(dong)存，－20℃保存。

3.   為避(bi)免降低活性，方(fang)便運(yun)輸，提供(gong)Lyticase(2500U)為(wei)凍幹(gan)粉(fen)狀，收(shou)到後(hou)，可短暫(zan)離(li)心後(hou)，加(jia)入0.25毫(hao)升(sheng)滅菌(jun)水溶解配制(zhi)成10U/μl，因為反復凍(dong)融(rong)可能會降低酶活(huo)性，因此溶解後(hou)立(li)即(ji)按(an)照(zhao)每次使用(yong)量分裝凍(dong)存，－20℃保存。

4.   避(bi)免試(shi)劑長(chang)時間暴露於空(kong)氣中(zhong)產(chan)生揮(hui)發(fa)、氧化(hua)、pH值(zhi)變(bian)化(hua)，各溶液(ye)使用(yong)後應及時蓋緊蓋子。

v 產(chan)品介紹：

該試(shi)劑盒(he)采用(yong)DNA吸附柱和獨you的溶(rong)液(ye)系(xi)統(tong)，適合於從(cong)多(duo)種(zhong)來源(yuan)的酵母培(pei)養(yang)物中(zhong)快(kuai)速簡(jian)單地提取(qu)基因組(zu)DNA。約3ml處(chu)於指數生(sheng)長(chang)期的酵母培(pei)養(yang)液(ye)壹般壹(yi)次(ci)抽(chou)提可純化(hua)出10-15μg的高質(zhi)量(liang)的基因組(zu)DNA。純化(hua)DNA產(chan)物可直接用(yong)於PCR、酶切(qie)和雜交等實驗(yan)。酵母細胞(bao)經(jing)lyticase處(chu)理(li)去除細胞(bao)壁後(hou)，獨te的結(jie)合(he)液(ye)/蛋(dan)白(bai)酶K迅(xun)速(su)裂(lie)解細胞(bao)和滅(mie)活(huo)細(xi)胞(bao)內(nei)核酸(suan)酶，然(ran)後(hou)基因組(zu)DNA在(zai)高(gao)離序鹽狀態(tai)下選(xuan)擇(ze)性吸附於離心柱內(nei)矽基質(zhi)膜(mo)， 再通過(guo)壹系(xi)列(lie)快(kuai)速的(de)漂(piao)洗－離心的(de)步(bu)驟，抑(yi)制(zhi)物去除液(ye)和漂(piao)洗液(ye)將(jiang)細(xi)胞(bao)代(dai)謝物，蛋(dan)白(bai)等雜質(zhi)去(qu)除，最(zui)後(hou)低(di)鹽的洗脫緩(huan)沖液(ye)將(jiang)純(chun)凈(jing)基因組(zu)DNA從(cong)矽(gui)基質(zhi)膜(mo)上洗脫。

v產(chan)品特點：

1.  離心吸(xi)附(fu)柱內(nei)矽基質(zhi)膜(mo)全部采用(yong)進(jin)口(kou)世(shi)界有(you)名公司特(te)制(zhi)吸附膜(mo)，柱與(yu)柱之(zhi)間吸附(fu)量差異(yi)極(ji)小，可重復(fu)性好(hao)。克(ke)服(fu)了國(guo)產(chan)試(shi)劑盒(he)膜質(zhi)量(liang)不穩定(ding)的弊端。

2.   不需要使(shi)用(yong)有毒的(de)ben酚等試(shi)劑，也(ye)不需要乙醇沈澱(dian)等步(bu)驟。

3.   快(kuai)速，簡(jian)捷(jie)，單個(ge)樣品裂解後操作壹般(ban)可在(zai)30分鐘內(nei)完(wan)成(cheng)。

4.   多(duo)次(ci)柱漂(piao)洗確保(bao)高純度(du)，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型(xing)的(de)比值(zhi)達(da)1.7～1.9，可直接用(yong)於PCR，Southern-blot和各種(zhong)酶切(qie)反應。

v  註意事(shi)項：

1.   所有(you)的離(li)心步(bu)驟均在(zai)室(shi)溫(wen)完(wan)成(cheng)，使(shi)用(yong)轉速可以達(da)到(dao)13,000rpm的傳統臺(tai)式離心機，如(ru)Eppendorf 5415C 或者類似離(li)心機。

2.   需要自(zi)備(bei)乙醇、異(yi)丙(bing)醇(chun)、β-巰基乙醇。

3.  開(kai)始(shi)實(shi)驗(yan)前將(jiang)需(xu)要的(de)水浴(yu)先(xian)預熱到37℃和70℃備(bei)用(yong)。

4.   結(jie)合(he)液(ye)CB 和抑(yi)制(zhi)物去除液(ye)IR中(zhong)含有(you)刺激性化(hua)合物，操作時要戴(dai)乳(ru)膠手套(tao)，避(bi)免沾(zhan)染(ran)皮(pi)膚，眼(yan)睛和衣(yi)服(fu)。若沾(zhan)染(ran)皮(pi)膚、眼(yan)睛時，要用(yong)大量清(qing)水(shui)或者生(sheng)理(li)鹽水沖洗。

5.   用(yong)戶需要自(zi)備(bei)Sorbitol buffer( 1M山(shan)li醇，0.1M Na₂EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。配(pei)制(zhi)方(fang)法(fa)：在(zai)600 ml 去(qu)離子水(shui)裏面(mian)溶解(jie) 182.2克(ke)山(shan)li醇，加(jia)入200 ml 0.5 M Na₂EDTA (pH 8.0)，不需要調(tiao)節(jie)PH值(zhi)，定(ding)容到(dao)1L，4℃保(bao)存。臨(lin)用(yong)前加0.1%β-巰基乙醇(商(shang)品化(hua)的β-巰基乙醇摩爾濃度壹(yi)般(ban)為14M)。

6.  菌體(ti)濃度檢(jian)測(ce)壹般OD600值(zhi)為(wei)1的(de)時候,釀酒(jiu)酵母細胞(bao)是1-2x10⁷ cells/ml，由(you)於菌種(zhong)和分光度(du)計(ji)不同即(ji)使同(tong)樣(yang)細(xi)胞(bao)數量(liang)OD值(zhi)變(bian)化(hua)也很大，以上僅(jin)供(gong)參考。

7.  洗脫液(ye)EB不含有(you)螯(ao)合(he)劑EDTA，不影響(xiang)下(xia)遊(you)酶切(qie)、連(lian)接等反應。也(ye)可以使(shi)用(yong)水洗脫，但應該確保(bao)批pH大於7.5，pH過低影響(xiang)洗脫效率。用(yong)水洗脫DNA應該保(bao)存在(zai)－20℃。DNA如(ru)果(guo)需要長(chang)期保存，可以用(yong)TE緩(huan)沖液(ye)洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影(ying)響(xiang)下(xia)遊(you)酶切(qie)反應，使(shi)用(yong)時可以適當(dang)稀釋(shi)。

v  操作步(bu)驟：（實(shi)驗(yan)前請(qing)先(xian)閱讀(du)註(zhu)意事(shi)項）

提示(shi)：

ð 第壹(yi)次使(shi)用(yong)前請(qing)先(xian)在(zai)15ml漂(piao)洗液(ye)WB中(zhong)加入60ml無(wu)水(shui)乙醇，充(chong)分混勻(yun)，加(jia)入後(hou)請(qing)及時在(zai)方(fang)框打(da)鉤標記已加入乙醇，以(yi)免多(duo)次(ci)加(jia)入!

ð 吸取(qu)使用(yong)量的Sorbitol buffer加(jia)入0.1%β-巰基乙醇，回(hui)復到(dao)室(shi)溫(wen)備(bei)用(yong)。

1. 取1-3毫(hao)升酵母培(pei)養(yang)物(不超過(guo)3X10⁷ cells，最(zui)好(hao)是早(zao)對(dui)數生(sheng)長(chang)期)，12,000rpm離心30秒(miao)，盡可能的(de)吸棄上清，收(shou)集菌(jun)體(ti)。

收(shou)集超(chao)過1.5毫升菌液(ye)，可以離(li)心棄上清後，在(zai)同(tong)壹個(ge)1.5ml管內(nei)加入更多(duo)的(de)菌(jun)液(ye)，重復(fu)步(bu)驟1，直(zhi)到(dao)收(shou)集到(dao)足夠的菌體(ti)。

2.加入600μl Sorbitol buffer，輕(qing)柔吹(chui)打充(chong)分重懸(xuan)細(xi)胞(bao)；可按(an)照(zhao)20-50U/1x10⁷cells的(de)比(bi)例(li)加入Lyticase(壹(yi)般(ban)3 ml培(pei)養(yang)物可能需(xu)要加(jia)到150U)，充分顛(dian)倒(dao)混勻(yun)，37℃溫(wen)育至少(shao)30分鐘消(xiao)化(hua)細胞(bao)壁，中(zhong)間可顛(dian)倒(dao)數次(ci)幫(bang)助(zhu)消(xiao)化(hua)。

如果(guo)破(po)壁(bi)效果(guo)不好(hao)導致(zhi)DNA產(chan)量低(di)，可以加(jia)大lyicase用(yong)量來提(ti)高(gao)酶工(gong)作濃度，還(hai)可以延長(chang)消(xiao)化(hua)時間來提(ti)高效果(guo)，不適合Lyticase消(xiao)化(hua)的酵母可選(xuan)用(yong)Zymolase或者其(qi)它方(fang)法(fa)如玻璃珠(zhu)渦旋(xuan)，煮沸，反(fan)復(fu)凍融(rong)等。

3. 13,000rpm離心1分鐘，盡可能吸(xi)棄上清，加180μl 緩(huan)沖液(ye)YB充分重懸(xuan)細(xi)胞(bao)團(tuan)。

4.  加入20μl的(de)蛋(dan)白(bai)酶K溶(rong)液(ye)(20mg/ml)，立(li)刻(ke)渦旋(xuan)振蕩(dang)充(chong)分混勻(yun)。

5. 將(jiang)混(hun)合(he)物放置(zhi)在(zai)55℃水(shui)浴(yu)消(xiao)化(hua)直到消(xiao)化(hua)完(wan)quan，期間輕柔的振蕩幾(ji)次(ci)幫(bang)助(zhu)裂解(jie)。

所需(xu)消(xiao)化(hua)時間和酵母數量(liang)、種(zhong)類和生(sheng)長(chang)狀態(tai)有關(guan)，壹(yi)般15分鐘即(ji)可，但是(shi)如果(guo)方(fang)便的話(hua)消(xiao)化(hua)過夜也(ye)無(wu)不良影(ying)響(xiang)。

可選(xuan)步(bu)驟，壹(yi)般(ban)不需要: 如(ru)果(guo)RNA殘(can)留(liu)較多(duo)，需(xu)要去(qu)除RNA，可在(zai)完(wan)成(cheng)操作步(bu)驟5後(hou)加(jia)20μl RNase A(25mg/ml)溶(rong)液(ye)，振蕩混(hun)勻(yun)，室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi)5-10分鐘。

6.加入200μl結(jie)合(he)液(ye)CB，立(li)刻(ke)渦旋(xuan)振蕩(dang)充(chong)分混勻(yun)，70℃放(fang)置(zhi)10分鐘。   

7.冷卻(que)後加(jia)入100μl 異(yi)丙(bing)醇(chun)，立(li)刻(ke)渦旋(xuan)振蕩(dang)充(chong)分混勻(yun)，此(ci)時可能會出現(xian)絮狀沈澱(dian)。

8. 將(jiang)上(shang)壹(yi)步(bu)混合(he)物（包(bao)括(kuo)可能有(you)的沈澱(dian)）加入壹(yi)個(ge)吸附(fu)柱AC中(zhong)，（吸附(fu)柱放入收(shou)集管(guan)中(zhong)）13,000rpm離心30-60秒(miao)，倒(dao)掉收(shou)集管(guan)中(zhong)的廢(fei)液(ye)。

9.加入500μl抑(yi)制(zhi)物去除液(ye)IR，12,000rpm 離心30秒(miao)，棄廢液(ye)。

10. 加入700μl漂(piao)洗液(ye)WB（請(qing)先(xian)檢查(zha)是(shi)否已(yi)加(jia)入無(wu)水(shui)乙醇!），12,000rpm離(li)心30秒(miao)，棄掉廢液(ye)。

11. 加入500μl漂(piao)洗液(ye)WB，12,000rpm 離心30秒(miao)，棄掉廢液(ye)。

12.將(jiang)吸(xi)附(fu)柱AC放回(hui)空(kong)收(shou)集管(guan)中(zhong)，13,000rpm離心2分鐘，盡量(liang)除(chu)去(qu)漂(piao)洗液(ye)，以免漂(piao)洗液(ye)中(zhong)殘(can)留(liu)乙醇抑(yi)制(zhi)下遊(you)反應。

13. 取出(chu)吸附(fu)柱AC，放入壹(yi)個(ge)幹凈(jing)的離心管(guan)中(zhong)，在(zai)吸(xi)附膜(mo)的中(zhong)間部位加(jia)100μl洗脫緩(huan)沖液(ye)EB（洗脫緩(huan)沖液(ye)事(shi)先(xian)在(zai) 65-70℃水(shui)浴(yu)中(zhong)預熱效果(guo)更好(hao)），室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi)3-5分鐘，12,000rpm離(li)心1分鐘。將(jiang)得(de)到(dao)的(de)溶(rong)液(ye)重新(xin)加(jia)入離(li)心吸(xi)附(fu)柱中(zhong)，室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi)2分鐘，12,000rpm離(li)心1分鐘。

洗脫體(ti)積越(yue)大，洗脫效率越高，如(ru)果(guo)需要DNA濃度較高，可以適當(dang)減少(shao)洗脫體(ti)積，但(dan)是最(zui)小體(ti)積不應少(shao)於50μl，體(ti)積過(guo)小降低DNA洗脫效率，減少(shao)DNA產(chan)量。

14.DNA可以存放在(zai)2-8℃，如(ru)果(guo)要長(chang)時間存放，可以放(fang)置(zhi)在(zai)－20℃。

v 問(wen)題與(yu)解(jie)決(jue)方(fang)法(fa)

酵母基因組(zu)DNA快(kuai)速提(ti)qu試(shi)劑盒(he) 核酸(suan)提取