雕亡(apoptosis)或(huo)程(cheng)序(xu)性死(si)亡的(de)細(xi)胞(bao)壹(yi)個形態(tai)學的(de)顯(xian)著特(te)點是(shi)染色(se)體(ti)DNA以(yi)核小體(ti)為單(dan)位（185 bp）規律斷裂形(xing)成(cheng)長度約(yue)為(wei)n×185bp (n=1,2,3,4…)的(de)DNA片(pian)段(duan)，經(jing)瓊(qiong)脂糖(tang)凝膠電(dian)泳(yong)顯(xian)示(shi)為階梯狀雕亡DNA Ladder，是(shi)雕亡細(xi)胞最直觀(guan)的(de)特(te)征。
選(xuan)擇(ze)性雕亡DNA Ladder抽(chou)提(ti)試劑盒(he) 核酸(suan)提(ti)取(qu)

選(xuan)擇(ze)性雕亡DNA Ladder抽(chou)提(ti)試劑盒(he) 核酸(suan)提(ti)取(qu)

選(xuan)擇(ze)性雕亡DNA Ladder抽(chou)提(ti)試劑盒(he)

目(mu)錄(lu)號(hao)：40117

試劑盒(he)組成(cheng)、儲存(cun)、穩定(ding)性：

註意(yi)事項：

為保(bao)持(chi)活(huo)性方(fang)便運輸，Enzyme B客戶收(shou)到(dao)時(shi)為凍(dong)幹粉，收到(dao)後(hou)加(jia)500µl滅菌(jun)水（25次(ci)）或(huo)者1ml滅(mie)菌(jun)水（50次(ci)）溶(rong)解(jie)後(hou)－20ºC保(bao)存。EnzymeA和(he)Enzyme B為(wei)酶(mei)溶(rong)液(ye)，應該(gai)避免反復凍(dong)融(rong)降(jiang)低(di)活性，如(ru)果(guo)要分(fen)多次(ci)使(shi)用(yong)，最(zui)好(hao)按(an)照(zhao)每次(ci)使(shi)用(yong)量(liang)分(fen)裝後(hou)－20ºC保(bao)存。

具體(ti)產品(pin)的(de)參(can)數(shu)以(yi)收(shou)到產品(pin)說(shuo)明(ming)書的(de)參(can)數(shu)為準(zhun)

產品(pin)介(jie)紹(shao)：

雕亡(apoptosis)或(huo)程(cheng)序(xu)性死(si)亡的(de)細(xi)胞(bao)壹(yi)個形態(tai)學的(de)顯(xian)著特(te)點是(shi)染色(se)體(ti)DNA以(yi)核小體(ti)為單(dan)位（185 bp）規律斷裂形(xing)成(cheng)長度約(yue)為(wei)n×185bp (n=1,2,3,4…)的(de)DNA片(pian)段(duan)，經(jing)瓊(qiong)脂糖(tang)凝膠電(dian)泳(yong)顯(xian)示(shi)為階梯狀雕亡DNA Ladder，是(shi)雕亡細(xi)胞最直觀(guan)的(de)特(te)征。本試劑盒(he)選(xuan)擇(ze)性從組織和(he)細(xi)胞(bao)中分(fen)離提(ti)取(qu)雕亡DNAladder，通(tong)過選(xuan)擇(ze)性分(fen)離基因組(zu)DNA與(yu)雕亡DNAladder，最(zui)大限(xian)度(du)的(de)減(jian)少了基(ji)因組(zu)DNA對(dui)雕亡DNA ladder的(de)觀(guan)察(cha)幹(gan)擾，因此顯(xian)著的(de)提(ti)高(gao)了檢測(ce)敏(min)感(gan)度，反應可(ke)在微量(liang)離(li)心(xin)管進行(xing)，2.5小時(shi)完成(cheng)，快速方(fang)便(bian)；無需(xu)有(you)機抽(chou)提(ti)，檢測(ce)靈(ling)敏(min)度(du)極(ji)gao，可(ke)從約2000個雕亡細(xi)胞中檢測(ce)到(dao)DNAladder。推(tui)薦起(qi)始(shi)細(xi)胞(bao)量(liang)為(wei)5～10×10⁵個，但投入的(de)細(xi)胞(bao)量(liang)可(ke)在1×10⁵~ 5×10⁶之(zhi)間(jian)變化。原(yuan)則是(shi)總細(xi)胞(bao)中應含有(you)至少約(yue)1～2×10⁴個雕亡細(xi)胞。多於(yu)2×10⁴個雕亡細(xi)胞通(tong)常(chang)可(ke)獲得十(shi)分清(qing)晰的(de)雕亡DNAladder。本試劑盒(he)也可(ke)用(yong)於(yu)從組織中提(ti)取(qu)雕亡DNAladder。但(dan)與培養(yang)細胞(bao)相(xiang)比，整(zheng)體(ti)動物(wu)組(zu)織雕亡細(xi)胞出現的(de)時(shi)間(jian)、部(bu)位、程(cheng)度(du)等(deng)規律性差(cha)往往造(zao)成(cheng)難(nan)以(yi)準(zhun)確取(qu)材，可(ke)能顯(xian)著影(ying)響實(shi)驗結(jie)果(guo)。但只(zhi)要組(zu)織確實(shi)發(fa)生(sheng)雕亡，有(you)經(jing)驗的(de)用(yong)戶(hu)也可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)本試劑盒(he)從組織提(ti)取(qu)雕亡DNAladder(參(can)見說(shuo)明(ming)4)。

產品(pin)說(shuo)明(ming):

1. 溴化乙錠染色(se)過度將(jiang)降(jiang)低(di)DNA條帶檢測(ce)靈(ling)敏(min)度(du)，可(ke)用(yong)水沖(chong)洗(xi)凝膠10～30分(fen)鐘(zhong)。如(ru)沖洗(xi)過頭可(ke)再用(yong)溴(xiu)化乙錠復染(ran)。可(ke)用(yong)更(geng)靈(ling)敏(min)的(de)DNA染(ran)色(se)劑SYBR Green。也可(ke)進行丙(bing)烯酰(xian)胺(an)DNA凝膠電(dian)泳(yong)和(he)DNA銀(yin)染(ran)。

2.對細(xi)胞進(jin)行幹(gan)預(yu)處(chu)理(li)後(hou)，雕亡可(ke)能僅在某(mou)壹(yi)時(shi)間(jian)點(dian)或(huo)某(mou)壹(yi)幹(gan)預(yu)強(qiang)度(du)下(xia)最為(wei)明(ming)顯(xian)。需(xu)要(yao)進(jin)行(xing)預(yu)試驗確定(ding)最(zui)佳(jia)幹(gan)預(yu)時(shi)間(jian)或(huo)強(qiang)度(du)。此時(shi)也可(ke)用(yong)雕亡小(xiao)體(ti)/hoeschst染色(se)試劑盒(he)(DN1801)快速染(ran)色(se)雕亡小(xiao)體(ti)觀察(cha)。

3.推(tui)薦起(qi)始(shi)細(xi)胞(bao)量(liang)為(wei)5～10×10⁵個，但投入的(de)細(xi)胞(bao)量(liang)可(ke)在1×10⁵~ 5×10⁶之(zhi)間(jian)變化。原(yuan)則是(shi)總細(xi)胞(bao)中應含有(you)至少約(yue)1～2×10⁴個雕亡細(xi)胞。多於(yu)2×10⁴個雕亡細(xi)胞通(tong)常(chang)可(ke)獲得十(shi)分清(qing)晰的(de)雕亡DNAladder。六(liu)孔板(ban)的(de)壹(yi)個孔相當(dang)於壹(yi)個35 mm培養(yang)皿長滿後(hou)可(ke)得到(dao)1～10×10⁵個細胞(bao)，如(ru)果(guo)細胞(bao)雕亡發(fa)生(sheng)率(lv)為10%，經(jing)過處(chu)理(li)可(ke)得到(dao)約1～10×10⁴個雕亡細(xi)胞，應該(gai)足以(yi)獲得清(qing)晰的(de)雕亡DNA ladder。反之(zhi)如(ru)果(guo)不(bu)能從>3×10⁶個細胞(bao)獲得清(qing)晰的(de)雕亡DNAladder，表(biao)明(ming)其中雕亡細(xi)胞少於(yu)1%。此時(shi)增加細胞(bao)用(yong)量(liang)也難(nan)已(yi)奏效(xiao)。

4. 從組織塊(kuai)提(ti)取(qu)雕亡DNAladder。取(qu)10～20 mg組織塊(kuai)放(fang)入小(xiao)玻(bo)璃(li)勻(yun)漿(jiang)器，加(jia)100～200μlExtraction buffer，上(shang)下(xia)手(shou)動勻(yun)漿(jiang)15～20次。取(qu)出(chu)勻(yun)漿(jiang)液(ye)，冰(bing)上(shang)5～10 min。振(zhen)蕩(dang)10秒(miao)。4500 rpm 10分(fen)鐘(zhong)收集(ji)上(shang)清(qing)液(ye)並(bing)轉(zhuan)移到(dao)新(xin)1.5ml離(li)心(xin)管，執行(xing)提(ti)取(qu)步(bu)驟3。另外(wai)壹(yi)種(zhong)方(fang)法是(shi)將30～50mg組(zu)織jian碎後(hou)在(zai)PBS裏(li)面勻(yun)漿(jiang)，制(zhi)成(cheng)細胞(bao)懸液(ye)，離(li)心(xin)收集細(xi)胞後(hou)接步(bu)驟2繼續(xu)執行(xing)提(ti)取(qu)。

5. 采(cai)用(yong)高(gao)質(zhi)量(liang)瓊(qiong)脂糖(tang)，使(shi)用(yong)寬(kuan)度較(jiao)小和(he)厚度(du)較(jiao)窄(zhai)的(de)樣(yang)品(pin)梳(shu)子，制(zhi)作(zuo)較(jiao)薄(bo)的(de)瓊(qiong)脂糖(tang)凝膠(厚度(du)約(yue)2～4 mm)；用(yong)較(jiao)低(di)的(de)電(dian)壓進(jin)行(xing)慢速電(dian)泳(yong)，將顯(xian)著增(zeng)加(jia)雕亡DNA條帶檢測(ce)靈(ling)敏(min)度(du)。電(dian)泳(yong)距(ju)離不(bu)要(yao)太(tai)長，否則將使(shi)小的(de)雕亡DNA條帶彌散(san)而(er)降(jiang)低(di)分辨(bian)率(lv)。

操作(zuo)步驟：

1.用(yong)PBS漂洗(xi)細胞兩(liang)遍後(hou)微(wei)型離心(xin)機500×g4ºC5min收(shou)集5～10×10⁵個細胞(bao)（最好(hao)同(tong)時(shi)做(zuo)壹(yi)個未雕亡細(xi)胞的(de)對(dui)照(zhao)）。小心(xin)用(yong)移(yi)液(ye)槍(qiang)吸棄(qi)上(shang)清(qing)，除(chu)盡管(guan)壁(bi)附著液(ye)體(ti)。

2. 將離(li)心(xin)管底部(bu)的(de)細(xi)胞(bao)沈澱(dian)用(yong)手(shou)指(zhi)輕輕彈松打(da)散(san)後(hou)，加(jia)入100µl的(de)Extraction buffer，用(yong)振(zhen)蕩(dang)器(qi)激烈(lie)混合10秒鐘(zhong)後(hou)，1,100～1,600 xg(約(yue)3500～4500rpm)離心(xin)5分鐘(zhong)。

3. 勿觸(chu)動管(guan)底(di)沈澱(dian)，將(jiang)上(shang)清(qing)液(ye)轉(zhuan)移到(dao)新(xin)的(de)1.5ml離(li)心(xin)管。

4. 沈澱(dian)按(an)操作(zuo)2.方法再重(zhong)復壹(yi)次(ci)。

5.把上(shang)清(qing)液(ye)與(yu)操作(zuo)3.的(de)上(shang)清(qing)液(ye)合(he)並(bing)於壹(yi)起(qi)共(gong)約(yue)200µl，作(zuo)為粗(cu)提(ti)取(qu)液(ye)(含有(you)雕亡DNA片(pian)段，未雕亡染(ran)色體(ti)DNA已(yi)經(jing)通(tong)過沈澱(dian)去(qu)除(chu))。

6.向粗提(ti)取(qu)液(ye)中加(jia)入10% SDS溶(rong)液(ye)20µl後(hou)，再(zai)加入Enzyme A 20µl，混勻(yun)，56℃溫育(yu)1小(xiao)時(shi)。

7.向上(shang)述(shu)混合液(ye)中加(jia)入Enzyme B 20µl，混勻(yun),37℃溫育(yu)1小(xiao)時(shi)，或(huo)者直到(dao)變得透(tou)亮(liang)（可(ke)過夜）。

8. 向上(shang)述(shu)混合液(ye)中加(jia)入Precipitant 130µl後(hou)，顛(dian)倒混勻(yun)，再(zai)加(jia)入(ru)1 ml的(de)乙(yi)醇，混勻(yun)後(hou)- 20℃放(fang)置1小(xiao)時(shi)以(yi)上(shang)（沈澱(dian)雕亡DNA片(pian)段）。

9. 至少13000rpm 4ºC離(li)心(xin)15min，棄(qi)上(shang)清(qing)，加1ml70％乙醇漂洗(xi)壹(yi)遍後(hou)離(li)心(xin)，倒去(qu)乙(yi)醇，並(bing)且盡量(liang)吸(xi)除(chu)管(guan)壁附(fu)著液(ye)體(ti)。敞開管(guan)口(kou)，室(shi)溫晾(liang)幹沈澱(dian)。

10. 用(yong)17µl雙(shuang)蒸水或(huo)TEBuffer充分溶解(jie)沈澱(dian)，加(jia)3µl6xDNA凝膠上(shang)樣(yang)緩沖(chong)液(ye)震(zhen)蕩(dang)混勻(yun)。取(qu)全(quan)部(bu)20µl上(shang)樣(yang)或(huo)者適(shi)量(liang)上(shang)樣(yang)進(jin)行1%agarose gels電(dian)泳(yong)。溴化乙錠染色(se)，紫(zi)外(wai)觀(guan)察(cha)照(zhao)相（雕亡發(fa)生(sheng)率(lv)較(jiao)低(di)時(shi)，添加過量(liang)TE Buffer溶(rong)解(jie)沈澱(dian)有(you)可(ke)能會(hui)導(dao)致(zhi)濃(nong)度(du)太(tai)稀，無法檢出DNA Ladder，因此可(ke)減少用(yong)量(liang)，反之(zhi)可(ke)增加）。

選(xuan)擇(ze)性雕亡DNA Ladder抽(chou)提(ti)試劑盒(he) 核酸(suan)提(ti)取(qu)