Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 采(cai)用Poly(A)加(jia)尾(wei)法(fa)原理， 首(shou)先(xian)miRNA 3’末(mo)端(duan)加(jia)Poly(A)尾(wei)，再(zai)使(shi)用Anchored oligo(dT)-universaltag通用逆轉錄引物(wu)進(jin)行逆(ni)轉錄反(fan)應(ying)，最(zui)終(zhong)生成miRNA 對(dui)應(ying)的(de)cDNA 第(di)壹(yi)鏈(lian)。
miRNA1stStandSynthesisKit(加(jia)尾(wei)法(fa))反(fan)轉錄

諾(nuo)博(bo)萊德 miRNA1stStandSynthesisKit(加(jia)尾(wei)法(fa))反(fan)轉錄

Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit
增(zeng)強型(xing)miRNA cDNA 第(di)壹(yi)鏈(lian)合成試(shi)劑盒(he)（加(jia)尾(wei)法(fa)）

目(mu)錄號：71418

產品(pin)內容

保(bao)存條(tiao)件

-20℃保存，有效(xiao)期(qi) 12 個月(yue)。

具體產(chan)品(pin)的(de)參數(shu)以(yi)收(shou)到產品(pin)說(shuo)明(ming)書的(de)參數(shu)為(wei)準(zhun)

產品(pin)簡(jian)介

Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 采(cai)用Poly(A)加(jia)尾(wei)法(fa)原理， 首(shou)先(xian)miRNA 3’末(mo)端(duan)加(jia)Poly(A)尾(wei)，再(zai)使(shi)用Anchored oligo(dT)-universaltag通用逆轉錄引物(wu)進(jin)行逆(ni)轉錄反(fan)應(ying)，最(zui)終(zhong)生成miRNA 對(dui)應(ying)的(de)cDNA 第(di)壹(yi)鏈(lian)。

本產(chan)品(pin)采(cai)用特殊優(you)化預(yu)混(hun)合(he)miRNA RT Enzyme Mix，將(jiang)Poly(A)加(jia)尾(wei)和反(fan)轉錄合並為(wei)壹(yi)步(bu)完成，簡(jian)化了(le)操(cao)作(zuo)步(bu)驟並(bing)提高了(le)Poly(A)加(jia)尾(wei)和逆(ni)轉錄效(xiao)率。

本產(chan)品(pin)具(ju)有可(ke)從20pg-2μg 的(de)Total RNA中高(gao)效(xiao)制(zhi)備(bei)miRNA對(dui)應(ying)的(de)cDNA 第(di)壹(yi)鏈(lian)。壹(yi)次合成的(de)cDNA可(ke)檢(jian)測多(duo)個microRNA，節約(yue)了RNA樣(yang)品(pin)和成本(ben)。

註(zhu)意事項(xiang)

1． 為(wei)保(bao)證(zheng)反(fan)轉錄成功(gong)，建議(yi)使(shi)用高質(zhi)量(liang)的(de)RNA樣品(pin)，以(yi)及避免(mian)RNase汙染。

2． 在反(fan)應(ying)中使(shi)用的(de)total RNA 必(bi)須(xu)包含(han)有小分(fen)子RNA(miRNA)。此(ci)過程也可(ke)以(yi)使用富集(ji)的(de)miRNA， 單純miRNA無法(fa)直接用分(fen)光光度(du)計(ji)定量(liang)，建議(yi)直接加(jia)入2μl ~5μl。可(ke)根(gen)據(ju)目(mu)的(de)miRNA豐度決定加(jia)入量(liang)，但是(shi)對於(yu)低豐度miRNA 樣品(pin)而(er)言(如(ru)血清血漿提取(qu)物)，可(ke)直接加(jia)入最(zui)大(da)體(ti)積8 μl。

3． miRNA RT Enzyme Mix比(bi)較(jiao)粘稠(chou)，容易吸(xi)附(fu)在管壁和吸(xi)頭(tou)外，導(dao)致(zhi)損(sun)失，使(shi)用前請(qing)點(dian)甩(shuai)離心(xin)後(hou)取(qu)用。miRNA RT Enzyme Mix包含(han)的(de)酶是(shi)過量(liang)的(de)，即使每(mei)次分(fen)別按照(zhao)1.8 μl使用，也不影響使用效(xiao)果。

miRNA 第(di)壹(yi)連 cDNA 合(he)成 (以(yi) 20 μl 反(fan)應(ying)體系(xi)為(wei)例(li))

重要提示：操(cao)作(zuo)前，請(qing)將各組(zu)分(fen)輕彈(dan)混(hun)勻(yun)，點(dian)甩(shuai)離心(xin)後(hou)置冰上備(bei)用。

1． 反(fan)應(ying)體系(xi)的(de)配制 (先(xian)加(jia)其他(ta)組分(fen)，最(zui)後(hou)再(zai)加(jia)入miRNA RT Enzyme Mix)於冰上，在(zai)PCR管(guan)中，加(jia)入以(yi)下組分(fen)：

輕(qing)柔(rou)吸(xi)打混(hun)勻(yun)，點(dian)甩(shuai)離心(xin)，收(shou)集(ji)溶(rong)液至管底(di)。

2． 42℃孵(fu)育60 min，進(jin)行(xing)miRNA 3’末(mo)端Poly (A)加(jia)尾(wei)和逆(ni)轉錄反(fan)應(ying)。

3． 85°C加(jia)熱(re)5 sec，終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)。

逆轉錄產物可(ke)立(li)即用於qPCR反(fan)應(ying)，或保(bao)存於-20°C，並(bing)在(zai)半年內使用；長期(qi)存放，請分(fen)裝後(hou)存於-70°C。

qPCR

推(tui)薦按照(zhao)金百特生物(wu)的(de)miRNA Real-Time PCR Assay kit （Cat#P419）進行(xing)定(ding)量(liang)實驗。

按照(zhao)上述操(cao)作(zuo)步(bu)驟得(de)到的(de)cDNA模(mo)板(ban)，用於下遊PCR或(huo)者熒光定(ding)量(liang)PCR檢(jian)測時，可(ke)以(yi)根(gen)據(ju)實(shi)際(ji)情(qing)況選擇使用量(liang)，對於(yu)特殊的(de)檢(jian)測體(ti)系(xi)中，高(gao)含(han)量(liang)的(de)cDNA模(mo)板(ban)易導(dao)致(zhi)非特異性(xing)擴(kuo)增，可(ke)根(gen)據(ju)所(suo)檢(jian)測miRNA 的(de)豐度適當的(de)稀釋cDNA（5-10倍(bei)或者100倍(bei)）後(hou)使(shi)用。如(ru)果發現有非特異擴(kuo)增條(tiao)帶，或者融鏈(lian)曲線(xian)顯示有非特異擴(kuo)增，往(wang)往(wang)提示cDNA模(mo)板(ban)過量(liang)，可(ke)以(yi)嘗試將(jiang)上(shang)述cDNA模(mo)板(ban)稀釋幾十(shi)到幾百倍(bei)甚至上千(qian)倍(bei)再(zai)使(shi)用。

相關(guan)產品(pin)：

71419 miRNA熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒（加(jia)尾(wei)法(fa)）

91015 通(tong)用型microRNA快(kuai)速提取(qu)試劑盒(Trizol + 吸(xi)附(fu)柱)

91409 動(dong)物(wu)組(zu)織/細(xi)胞microRNA快(kuai)速提取(qu)試劑盒(免氯(lv)仿(fang))

91410 植(zhi)物(wu)microRNA快速提取(qu)試劑盒(免氯(lv)仿(fang))

91416 血清血漿microRNA提取(qu)試劑盒(RNAzol LS+吸(xi)附(fu)柱)

91613 細(xi)菌(jun)microRNA提取(qu)試劑盒(免氯(lv)仿(fang))

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