Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采(cai)用第三(san)代(dai)高(gao)效(xiao)逆轉錄(lu)酶，具有(you)更(geng)強的延(yan)伸(shen)能力和(he)穩(wen)定性(xing)，並配(pei)備(bei)了具有(you)DNA分解(jie)活性(xing)的特(te)殊dsDNase，只(zhi)需壹(yi)步操作， 即(ji)可同(tong)時完成(cheng)基(ji)因(yin)組清除(chu)與(yu)莖環法miRNA逆轉錄(lu)反(fan)應，操作方便快(kuai)捷(jie)。
IIImiRNAFirstStandSynthesisKit反(fan)轉錄(lu)試(shi)劑

諾(nuo)博(bo)萊德 IIImiRNAFirstStandSynthesisKit反(fan)轉錄(lu)試(shi)劑

Script III miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）莖(jing)環法 miRNA 第壹(yi)連反(fan)轉錄(lu)試(shi)劑盒(he)

目錄(lu)號:71505

產(chan)品(pin)內(nei)容

保(bao)存條(tiao)件(jian)

-20℃保(bao)存，有(you)效期 12 個(ge)月(yue)。

具體(ti)產(chan)品(pin)的參(can)數以收(shou)到產品(pin)說明(ming)書的參(can)數為準(zhun)

產(chan)品(pin)簡(jian)介(jie)

Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采(cai)用第三(san)代(dai)高(gao)效(xiao)逆轉錄(lu)酶，具有(you)更(geng)強的延(yan)伸(shen)能力和(he)穩(wen)定性(xing)，並配(pei)備(bei)了具有(you)DNA分解(jie)活性(xing)的特(te)殊dsDNase，只(zhi)需壹(yi)步操作， 即(ji)可同(tong)時完成(cheng)基(ji)因(yin)組清除(chu)與(yu)莖環法miRNA逆轉錄(lu)反(fan)應，操作方便快(kuai)捷(jie)。逆轉錄(lu)產物可以用於後續的染(ran)料(liao)法或探針法熒(ying)光(guang)定量檢(jian)測。此(ci)方法特異(yi)性(xing)高(gao)只(zhi)對成(cheng)熟(shu)的miRNA進(jin)行(xing)反(fan)轉，不(bu)受(shou)其(qi)前體(ti)幹擾，序(xu)列高(gao)度(du)同(tong)源(yuan)的miRNA也(ye)可精(jing)確(que)區分。本(ben)試(shi)劑盒(he)具有(you)可從(cong)20 pg ~ 2 μg的total RNA中(zhong)高(gao)效(xiao)制備(bei)miRNA對應的第(di)壹(yi)鏈cDNA。

原(yuan)理：本(ben)試(shi)劑盒(he)采用莖環結(jie)構的逆轉錄(lu)引物與(yu) miRNA 分子的3’端 結(jie)合，並(bing)在逆轉錄(lu)酶的作用下進行(xing)反(fan)應，獲得(de)人為加長(chang)的 miRNA 第(di)壹(yi)鏈 cDNA。

引物的制備(bei)：

需(xu)要(yao)自(zi)己(ji)設(she)計、合成(cheng)用於反(fan)轉錄(lu)的頸環引物！

microRNA莖(jing)環引物及(ji)Realtime-PCR引物設(she)計(ji)方(fang)法如下(xia)：

1. stem-loop RT引物設(she)計(ji)：

基(ji)於(yu)通(tong)用的莖(jing)環結(jie)構，只(zhi)需要(yao)按照(zhao)不(bu)同(tong)的miRNA序(xu)列(lie)修改(gai)最末端6個(ge)堿(jian)基(ji)即(ji)可。通(tong)用莖環結(jie)構序(xu)列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

例(li)如設(she)計(ji)miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只(zhi)需在通(tong)用莖環序(xu)列(lie)後加(jia)上(shang)miRNA3’末端的6個(ge)堿(jian)基(ji)的反(fan)向(xiang)互(hu)補(bu)序(xu)列，即(ji)GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACATACAT。

2. realtime 上(shang)遊引物設(she)計(ji)：

miRNA序(xu)列(lie)除(chu)去(qu)3’端6個(ge)堿(jian)基(ji) 的剩(sheng)余(yu)部(bu)分作為上遊引物，如miR-1的上(shang)遊引物為(註(zhu)意(yi) 把(ba)U改(gai)為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢(jian)查(zha)引物的Tm 值（壹般參(can)考(kao)DNAMAN），如果Tm值較(jiao)低，則在5’端加GC使(shi)Tm值接近60度(du)。因(yin)此(ci)miR-1的上(shang)遊引物可設(she)計(ji) 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度(du)。

下(xia)遊引物是通(tong)用的，序(xu)列(lie)為GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物設(she)計(ji)好(hao)後，需(xu)要(yao)通(tong)過預試(shi)驗檢(jian)測引物的特(te)異(yi)性(xing)。壹般需要(yao)做(zuo)溶解(jie)曲線來檢(jian)測(ce)引物的特(te)異(yi)性(xing)；同(tong)時最好(hao)將(jiang)PCR產(chan)物(wu)進(jin)行(xing)電(dian)泳(yong)檢(jian)測(ce)產物是否單壹(yi)（產物(wu)長(chang)度很(hen)短(duan)，需要3%以上的瓊(qiong)脂(zhi)糖膠）

操作步驟(zhou)： (以20 μl反(fan)應體(ti)系(xi)為例(li))

1．莖(jing)環法反(fan)轉錄(lu)體(ti)系(xi)的配(pei)制

使(shi)用 RNase-Free PCR 管(guan)在冰上(shang)配(pei)制：(使(shi)用前，請(qing)將各(ge)組分輕(qing)彈(dan)混勻，點(dian)甩離心收(shou)集(ji)至(zhi)管(guan)底(di)，置(zhi)冰(bing)上(shang)備(bei)用。)

2．輕(qing)柔吸打(da)混勻，點(dian)甩離心，置 PCR 儀(yi)進行(xing)逆轉錄(lu)反(fan)應。

25℃孵(fu)育 5 min 後， 42℃孵(fu)育 20 min，85°C 加(jia)熱(re) 5 sec，失(shi)活 RTase 和(he) dsDNase，終(zhong)止反(fan)應。

3．合(he)成(cheng)的cDNA反(fan)應液(ye)可放(fang)置(zhi)於-20℃保(bao)存，也(ye)可以直接(jie)進行(xing)下遊PCR或者熒(ying)光(guang)定量qPCR檢(jian)測(ce)。

註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)：

1. 在反(fan)應中(zhong)使(shi)用的total RNA 必(bi)須含有(you)小分子RNA 。

2. 此(ci)過程也(ye)可以使(shi)用小分子RNA， miRNA無法直接(jie)用分光(guang)光(guang)度計定量，建(jian)議加(jia)入量為2μl ~5μl。可根(gen)據(ju)目的miRNA豐(feng)度(du)決(jue)定加入量，但(dan)是對於(yu)低豐度miRNA 樣(yang)品而(er)言(yan)(如血(xue)清血(xue)漿提取物)，可直(zhi)接(jie)加入最大(da)體(ti)積8 μl。

3.  5 × miRT Reaction Mix非(fei)常粘稠(chou)，溶(rong)液(ye)容易(yi)吸(xi)附(fu)在管壁和(he)吸頭外(wai)導(dao)致(zhi)損(sun)失，用前請(qing)點(dian)甩離心後使(shi)用，並且(qie)避(bi)免吸(xi)頭外(wai)壁沾(zhan)附(fu)損(sun)失。可以每次(ci)按照(zhao)3.6-3.8μl使(shi)用，也(ye)不(bu)影(ying)響使(shi)用效果。

按照(zhao)miRNA熒(ying)光(guang)定量PCR檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)(貨(huo)號(hao)P501)進(jin)行(xing)qPCR。

註(zhu)：按照(zhao)上(shang)述操作步驟(zhou)得(de)到(dao)的cDNA模(mo)板(ban)用於下遊PCR或者熒(ying)光(guang)定量PCR檢(jian)測(ce)時，可以根(gen)據(ju)實(shi)際情(qing)況選擇使(shi)用量，對於(yu)特殊的檢(jian)測(ce)體(ti)系(xi)中(zhong)，高(gao)含量的cDNA模(mo)板(ban)易導(dao)致(zhi)非(fei)特異(yi)性(xing)擴增，可根(gen)據(ju)所(suo)檢(jian)測(ce)miRNA的豐(feng)度(du)適當的稀(xi)釋(shi)cDNA（5-10倍或者100倍）後使(shi)用。如果發(fa)現(xian)有(you)非(fei)特異(yi)擴增條(tiao)帶(dai)，或者融鏈曲線顯示有(you)非(fei)特異(yi)擴增，往往提示(shi)cDNA模(mo)板(ban)過量，可以嘗試(shi)將上(shang)述cDNA模(mo)板(ban)稀(xi)釋(shi)幾十到幾(ji)百(bai)倍甚至(zhi)上(shang)千倍再(zai)使(shi)用。

IIImiRNAFirstStandSynthesisKit反(fan)轉錄(lu)試(shi)劑