CRISPR/Cas9介導的(de)基因(yin)編輯技(ji)術是(shi)現在(zai)生物學(xue)、醫(yi)學(xue)和育種研(yan)究(jiu)等(deng)領(ling)域的常(chang)用手段。該(gai)技(ji)術體(ti)系僅需(xu)要(yao)Cas9蛋白(bai)和sgRNA即(ji)可(ke)實(shi)現(xian)高(gao)效(xiao)的基因(yin)編輯，其(qi)中(zhong)Cas9蛋白(bai)是通用組(zu)分（無(wu)需修(xiu)改），sgRNA則需要(yao)根據不同靶位(wei)點來(lai)設(she)計(ji)和轉(zhuan)錄(lu)。
高(gao)效(xiao)sgRNA體外轉(zhuan)錄(lu)試(shi)劑盒(he)

諾博萊(lai)德(de) 高(gao)效(xiao)sgRNA體外轉(zhuan)錄(lu)試(shi)劑盒(he)

FlashPure sgRNASynthesis Kit高(gao)效(xiao) sgRNA 體外轉(zhuan)錄(lu)試(shi)劑盒(he)

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CRISPR/Cas9介(jie)導(dao)的基因(yin)編輯技(ji)術是(shi)現在(zai)生物學(xue)、醫(yi)學(xue)和育種研(yan)究(jiu)等(deng)領(ling)域的常(chang)用手段。該(gai)技(ji)術體(ti)系僅需(xu)要(yao)Cas9蛋白(bai)和sgRNA即(ji)可(ke)實(shi)現(xian)高(gao)效(xiao)的基因(yin)編輯，其(qi)中(zhong)Cas9蛋白(bai)是通用組(zu)分（無(wu)需修(xiu)改），sgRNA則需要(yao)根據不同靶位(wei)點來(lai)設(she)計(ji)和轉(zhuan)錄(lu)。

高(gao)效(xiao)sgRNA體外轉(zhuan)錄(lu)試(shi)劑盒(he)采(cai)用T7 RNA聚合酶(mei)復(fu)合物(wu)高(gao)效(xiao)轉(zhuan)錄(lu)spCas9sgRNA。試(shi)劑盒(he)中的反應(ying)體(ti)系根據sgRNA特(te)點(dian)進(jin)行優(you)化，每個反(fan)應(ying)可(ke)在4小時內（實(shi)際操作為半(ban)天(tian)或1天(tian)之內）獲(huo)得(de)多(duo)達100~200μg的sgRNA。sgRNA可直(zhi)接用Cas9蛋(dan)白體外切割(ge)，純(chun)化後(hou)可用於(yu)細(xi)胞註(zhu)射(she)等(deng)實(shi)驗(yan)。

試(shi)劑盒(he)中配備了合成sgRNA轉(zhuan)錄(lu)模板，sgRNA轉(zhuan)錄(lu)所需的全(quan)部(bu)試(shi)劑，用戶僅需(xu)要(yao)合成含(han)有(you)1條(tiao)CRISPR靶(ba)點的引物就(jiu)能完(wan)成sgRNA體外(wai)轉(zhuan)錄(lu)。

操作步驟(zhou)：

1. 設計PCR正(zheng)向引物，替(ti)換(huan)標紅的(de)N(20)即(ji)可：

Primer Target：5’TAATACGACTCACTATAGGN(20)GTTTTAGAGCTAGAAATA -3’

註(zhu)：spCas9識(shi)別的靶點為20nt，共(gong)20個堿(jian)基序列(lie)，N(20)為靶(ba)位(wei)點不包含(han)PAM的(de)20個堿(jian)基序列(lie)，建(jian)議避(bi)免(mian)選(xuan)擇有(you)3個（或(huo)3個以(yi)上(shang)）連(lian)續(xu)T堿(jian)基的位(wei)點。

2. 找(zhao)公(gong)司合成Primer Target，稀(xi)釋到 1mM 濃(nong)度備用。

3. 配制PCR反應(ying)體(ti)系：

4. 制(zhi)備體外(wai)轉(zhuan)錄(lu)模板，設置反(fan)應(ying)程(cheng)序如下：

5. 按(an)下表(biao)配制sgRNA轉(zhuan)錄(lu)體系(xi)，37℃反應(ying)4 hours。（操(cao)作過程(cheng)中(zhong)采(cai)用無(wu)RNA酶耗(hao)材）

6. (可選(xuan)步驟(zhou)) 在反(fan)應(ying)體(ti)系中(zhong)加入1 μL的(de)DNase I ，37℃孵(fu)育 15 min，消化轉(zhuan)錄(lu)的DNA模板。

7. 過(guo)柱純化：

提示(shi)：第壹(yi)次使(shi)用前(qian)請先在(zai) Wash Solution 1 瓶(ping)和 Wash Solution 2/3 瓶(ping)中(zhong)加入無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)，加入體(ti)積請參(can)照瓶(ping)上(shang)的(de)標簽(qian)，並做(zuo)好標記(ji)。sgRNA 容(rong)易降解，全(quan)程(cheng)使用無(wu)酶耗(hao)材，請小心操作、避(bi)免(mian)降(jiang)解。

（1）於(yu)冰(bing)上，用 RNase-Free H2O 將(jiang) RNA 樣品補(bu)足(zu)至(zhi) 100 μL， 加入 200 μL Buffer MRC，輕(qing)柔(rou)混勻。

（2）加入 375 μL（1.25 倍(bei)體(ti)積）無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)並混勻。

（3）將(jiang)上(shang)壹(yi)步所得溶(rong)液(ye)加入壹(yi)套(tao)吸(xi)附柱中，13,000 rpm 離(li)心 30 sec，棄(qi)濾(lv)液(ye)，將(jiang)吸(xi)附柱重(zhong)新套(tao)回收集(ji)管。

（4）加入 700 μl Wash Solution 1（請先檢查是否已加入無(wu)水(shui)乙(yi) 醇(chun)），13,000 rpm 離心 30 sec，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

（5）漂(piao)洗(xi)：加入 500 μl Wash Solution 2/3，13,000 rpm 離(li)心 30 sec，棄(qi)濾(lv)液(ye)。

（6）二(er)次(ci)漂(piao)洗(xi)：重(zhong)復步(bu)驟(zhou)（5）壹(yi)次。

（7）幹(gan)燥：將(jiang)離(li)心吸(xi)附柱於(yu) 13,000 rpm 離(li)心 2 min，甩幹(gan)殘(can)留的漂洗(xi)液(ye)。

（8）洗(xi)脫：將(jiang)吸(xi)附柱放入壹(yi)個新(xin)的(de) 1.5 ml 離心管中(zhong)，在(zai)吸(xi)附膜(mo)的(de)中(zhong)央(yang)懸空滴加 10 ~ 40 μl RNase-Free H2O，室溫放(fang)置 2 min，13,000 rpm 離心 1 min，收集(ji) sgRNA，用於(yu)後(hou)續(xu)實(shi)驗(yan)。