零(ling)背(bei)景(jing)平(ping)末端快(kuai)速(su)連(lian)接(jie)試(shi)劑(ji)盒(he)是(shi)壹種(zhong)優(you)良的zi殺(sha)基(ji)因陽(yang)性選擇克隆系(xi)統(tong)，可以高(gao)效(xiao)克隆平(ping)末端 PCR 產(chan)物(wu)和任(ren)何具(ju)有(you)平(ping)末端的DNA 片段(duan)。該試劑盒(he)對(dui)磷酸(suan)化(hua)或(huo)非(fei)磷酸(suan)化(hua)的 DNA 片段(duan)都有(you)效(xiao)。 陽性選擇載體和插入片段(duan)連(lian)接(jie)僅(jin)需 5 分鐘(zhong)即(ji)可獲(huo)得(de)超過 95%的陽(yang)性(xing)重(zhong)組(zu)克隆。由具(ju)有(you)校(xiao)正活性的聚(ju)合(he)酶(mei)擴(kuo)增的平(ping)末端 PCR 產(chan)物(wu)可(ke)直接連(lian)入(ru)克(ke)隆(long)載體。
零(ling)背(bei)景(jing)平(ping)末端快(kuai)速(su)克(ke)隆(long)試(shi)劑盒(he)T4原理載體

零(ling)背(bei)景(jing)平(ping)末端快(kuai)速(su)克(ke)隆(long)試(shi)劑盒(he)T4原理載體

ZERO-Blunt零(ling)背(bei)景(jing)平(ping)末端快(kuai)速(su)克(ke)隆(long)試(shi)劑盒(he)

目錄(lu)號(hao)：42018

試(shi)劑(ji)盒(he)組(zu)成(cheng)、儲(chu)存、穩定性：

－20℃儲(chu)存，6個月內不(bu)影(ying)響使用(yong)效(xiao)果(guo)。

具(ju)體產(chan)品的參(can)數以(yi)收到產(chan)品說(shuo)明書的參(can)數為(wei)準(zhun)

v  產(chan)品介(jie)紹：

零(ling)背(bei)景(jing)平(ping)末端快(kuai)速(su)連(lian)接(jie)試(shi)劑(ji)盒(he)是(shi)壹種(zhong)優(you)良的自(zi)sha基(ji)因陽(yang)性選擇克隆系(xi)統(tong)，可以高(gao)效(xiao)克隆平(ping)末端 PCR 產(chan)物(wu)和任(ren)何具(ju)有(you)平(ping)末端的DNA 片段(duan)。該試劑盒(he)對(dui)磷酸(suan)化(hua)或(huo)非(fei)磷酸(suan)化(hua)的 DNA 片段(duan)都有(you)效(xiao)。 陽性選擇載體和插入片段(duan)連(lian)接(jie)僅(jin)需 5 分鐘(zhong)即(ji)可獲(huo)得(de)超過 95%的陽(yang)性(xing)重(zhong)組(zu)克隆。由具(ju)有(you)校(xiao)正活性的聚(ju)合(he)酶(mei)（如(ru)：Pfu polymerase）擴增(zeng)的平(ping)末端 PCR 產(chan)物(wu)可(ke)直接連(lian)入(ru)克(ke)隆(long)載體。連(lian)接(jie)產(chan)物(wu)可(ke)直接轉化常用(yong)的大腸桿(gan)菌(jun)菌(jun)株。

試(shi)劑(ji)盒(he)提(ti)供(gong)壹個新穎(ying)的自(zi)sha基(ji)因陽(yang)性選擇克隆載體pZERO-Blunt。該(gai)載體含(han)有(you)致(zhi)死(si)的自(zi)sah基(ji)因（內(nei)含(han)多克(ke)隆位(wei)點），當(dang)載體與(yu)片段(duan)連(lian)接(jie)成(cheng)功(gong)，自sha基(ji)因無(wu)法正確表(biao)達，包含(han)重組(zu)子的細(xi)胞(bao)可(ke)以(yi)正常生(sheng)長(chang)；當(dang)載體與(yu)片段(duan)連(lian)接(jie)不(bu)成(cheng)功(gong)，載體自(zi)連(lian)後(hou)自(zi)sha基(ji)因正(zheng)確表(biao)達，包含(han)自連(lian)空(kong)載體的細(xi)胞(bao)無(wu)法(fa)存活，即(ji)“零(ling)ZERO"背(bei)景(jing)。這種(zhong)陽性(xing)篩(shai)選(xuan)策略無(wu)需藍(lan)白斑(ban)篩(shai)選(xuan)，極大地(di)加(jia)速(su)了克(ke)隆(long)篩(shai)選(xuan)進程。

為(wei)方(fang)便(bian)酶(mei)切(qie)作圖(tu)和插入片段(duan)基(ji)因操(cao)作，pZERO-Blunt克隆載體的多克(ke)隆位(wei)點兩(liang)側(ce)各包(bao)含(han)壹個BglII識(shi)別序列(lie)。此(ci)外(wai)，該載體含(han)有(you)T7啟(qi)動(dong)子(zi)，可(ke)用(yong)於(yu)體內(nei)或(huo)體外(wai)轉錄(lu)、插入片段(duan)測序等(deng)研(yan)究。

操(cao)作(zuo)步(bu)驟：

1.    連(lian)接(jie)反應(ying)的準(zhun)備：

平(ping)末端PCR產(chan)物(wu)或(huo)者(zhe)酶(mei)切(qie)後平(ping)末端片段(duan)可以通過瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝膠電(dian)泳分離回收（使用(yong)長(chang)波(bo)紫外(wai)光下切(qie)膠或(huo)者(zhe)可(ke)見(jian)光(guang)透(tou)射(she)切(qie)膠避(bi)免(mian)DNA損(sun)傷(shang)造(zao)成(cheng)連(lian)接(jie)失敗(bai)）。與(yu)載體的摩爾比(bi)是(shi) 3:1。本公司(si)生(sheng)產(chan)的DNA產(chan)物(wu)快(kuai)速(su)純(chun)化回收試(shi)劑盒(he)對(dui)70bp以(yi)上(shang)的DNA片段(duan)能很(hen)好地(di)進(jin)行回收。

2.    快(kuai)速(su)連(lian)接(jie)反應(ying)：

1)   在壹個標準的10 ml連(lian)接(jie)反應(ying)體系(xi)中(zhong)，加(jia)入1 ml 40ng pZERO-Blunt 載體、X ml PCR產(chan)物(wu)(在通(tong)常狀(zhuang)況下，沒(mei)有(you)必(bi)要(yao)對(dui)PCR產(chan)物(wu)進(jin)行精(jing)確(que)定量，壹般PCR產(chan)物(wu)與(yu)載體的摩爾比(bi)優(you)化至(zhi)1:1~10:1就(jiu)可以得(de)到良(liang)好結果(guo)，推(tui)薦(jian)3:1，見附(fu)錄(lu))、5ml 2 ´ Quick ligation Buffer和0.9ml 的T4 DNA Ligase，其(qi)余用(yong)滅菌水(shui)補足。

     反應(ying)按(an)以(yi)下體系(xi)進(jin)行：

壹般最後加(jia)入T4 DNA Ligase。

2)   22℃連(lian)接(jie)5-10分(fen)鐘(zhong)（壹般可在PCR儀(yi)器(qi)完(wan)成(cheng)）。

通(tong)常推(tui)薦(jian)22℃連(lian)接(jie)5-10分(fen)鐘(zhong) ，>3kb長(chang)片段(duan)連(lian)接(jie)可(ke)以(yi)延(yan)長(chang)至(zhi)30分(fen)鐘(zhong)。不(bu)推(tui)薦(jian)超過30分鐘，超過可能降低(di)轉(zhuan)化子(zi)數量(liang)。

3)   冰(bing)上(shang)冷(leng)卻，然(ran)後轉(zhuan)化或(huo)貯(zhu)存於-20℃。

3.    轉(zhuan)化(hua)：

1)  100ml感(gan)受(shou)態細(xi)胞，置(zhi)於冰(bing)上(shang)，完(wan)quan解(jie)凍後(hou)輕(qing)撣幾次將(jiang)細(xi)胞(bao)均勻(yun)懸(xuan)浮。

2) 加(jia)入4－5ml連(lian)接(jie)液(ye)(最多可(ke)全部(bu)加(jia)入，只(zhi)要(yao)連(lian)接(jie)液(ye)體積(ji)不(bu)超過感受(shou)態細(xi)胞體積(ji)的1/10)，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(yun)。冰(bing)上(shang)放置(zhi)30分鐘(zhong)。

3)   42℃水(shui)浴(yu)熱(re)激90秒。冰(bing)上(shang)放置(zhi)2~3分鐘(zhong)。

4) 加(jia)500ml LB或(huo)者(zhe)SOC培養(yang)基(ji)(不(bu)含(han)抗生(sheng)素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yang)60分(fen)鐘(zhong)。

5) 將(jiang)200ml細(xi)菌(jun)塗布(bu)在氨(an)芐(bian)qing黴(mei)素(100mg/ml)平(ping)板上(shang)。

塗布(bu)細菌(jun)的用(yong)量(liang)依連(lian)接(jie)的效(xiao)率及(ji)感(gan)受(shou)態細(xi)胞的感(gan)受(shou)率而(er)進(jin)行適當(dang)的調(tiao)整，如果(guo) 預(yu)計(ji)的克(ke)隆(long)較(jiao)少，可通(tong)過離心（4,000rpm，2 分鐘(zhong)）後(hou)吸除部(bu)分培養(yang)液(ye)，留下適(shi)量的培養(yang)基(ji)懸(xuan)浮菌(jun)體後(hou)取(qu)全部(bu)或(huo)者(zhe)適(shi)量(liang)塗布(bu)於壹個平(ping)板中(zhong)（塗布(bu)剩余的菌(jun)液(ye)可以(yi)擱(ge)在4度保(bao)存，第2天如果(guo)轉(zhuan)化(hua)菌(jun)落數量(liang)少，可將(jiang)剩(sheng)余菌液(ye)全部(bu)塗壹個新培養(yang)板(ban))。

6)   平(ping)板在37℃下正(zheng)向(xiang)放置(zhi)1小(xiao)時以(yi)吸收過多的液(ye)體，然(ran)後倒(dao)置培養(yang)過夜(ye)。

5     篩(shai)選(xuan)：

1).  常規檢測：將(jiang)得(de)到的菌(jun)落接(jie)種(zhong) 1-5 ml LB（含(han)有(you)終(zhong)濃(nong)度為(wei) 100mg /ml 的氨(an)芐(bian)qing黴(mei)素）培養(yang)基(ji)，37℃搖(yao)床(chuang)振蕩培養(yang)過夜(ye)，保(bao)存菌種(zhong)後提(ti)取(qu)質粒(li)，應用(yong) PCR 或(huo)酶(mei)切(qie)方法(fa)鑒定插入片段(duan)是(shi)否(fou)正確(que)。

2). 快(kuai)速(su)檢測：挑(tiao)取(qu)菌落直接進行PCR檢測（可(ke)參(can)見分(fen)子克隆第3版本或(huo)者(zhe)參(can)考(kao)本公司(si)CV05-通(tong)用(yong)T載體菌(jun)落PCR鑒(jian)定試劑(ji)盒(he)說(shuo)明書）。
   3).  測(ce)序鑒(jian)定：使用(yong)試(shi)劑盒(he)自(zi)帶引物(wu)或(huo)者(zhe)T7啟(qi)動(dong)子(zi)引物(wu)測(ce)序確(que)定是(shi)否(fou)含(han)有(you)目的克(ke)隆(long)。  

本(ben)試(shi)劑盒(he)自(zi)帶測序引物(wu)（也(ye)用(yong)於(yu)菌落PCR鑒(jian)定引物(wu)）：                                                                                    

v  附(fu)錄(lu)：

ð  如(ru)何計(ji)算連(lian)接(jie)反應(ying)中(zhong)需要(yao)的PCR產(chan)物(wu)的量(liang)?

壹般PCR產(chan)物(wu)與(yu)載體的摩爾比(bi)優(you)化至(zhi)1:1~10:1（推(tui)薦(jian)3:1）就(jiu)可以得(de)到良(liang)好結果(guo)，可(ke)采(cai)用(yong)以(yi)下公式：

 [加(jia)入載體的量(liang)（ng）×插入片段(duan)大小(xiao)（kb）÷載體大小(xiao)（kb）]×插入片段(duan)和載體的摩爾比(bi)=插入片段(duan)的量(liang)（ng） 例(li)如(ru)：插入片段(duan)和載體連(lian)接(jie)的摩爾比(bi)例(li)為(wei)3:1，如(ru)連(lian)接(jie)反應(ying)中(zhong)加(jia)入載體40ng，插入片段(duan)大小(xiao)為(wei)500bp，這時應(ying)加(jia)入插入片段(duan)的量(liang)為(wei)[40ng載體×0.5kb插入片段(duan)÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。

零(ling)背(bei)景(jing)平(ping)末端快(kuai)速(su)克(ke)隆(long)試(shi)劑盒(he)T4原理載體