pBLUE-T Simple Vector是(shi)壹(yi)種高效(xiao)克(ke)隆(long)PCR產(chan)物 (TA Cloning) 的(de)專用載(zai)體(ti)。這(zhe)種(zhong)載(zai)體(ti)是(shi)由(you)pBlueScript II SK(+)質(zhi)粒改(gai)建而(er)成(cheng)，和(he)傳(chuan)統T載(zai)體(ti)ECOR V切(qie)開(kai)後加(jia)T方(fang)法(fa)不(bu)同，pSURE-T Simple 通過(guo)改(gai)造pBlueScript II SK(+)，
Simple載(zai)體(ti)快(kuai)速(su)克隆(long)試劑盒(he) T4原(yuan)理載(zai)體(ti)

諾(nuo)博(bo)萊(lai)德(de) Simple載(zai)體(ti)快(kuai)速(su)克隆(long)試劑盒(he) T4原(yuan)理載(zai)體(ti)

pBLUE-T Simple載(zai)體(ti)快(kuai)速(su)克隆(long)試劑盒(he)

目(mu)錄號：42119

試劑盒(he)組(zu)成(cheng)、儲存、穩(wen)定性(xing)：

－20℃儲(chu)存，6個(ge)月(yue)內不(bu)影響(xiang)使(shi)用效(xiao)果(guo)。

具體(ti)產(chan)品(pin)的(de)參數(shu)以(yi)收(shou)到產(chan)品(pin)說(shuo)明書(shu)的(de)參數(shu)為準

產(chan)品(pin)介(jie)紹：

pBLUE-T Simple Vector是(shi)壹(yi)種(zhong)高效(xiao)克(ke)隆(long)PCR產(chan)物 (TA Cloning) 的(de)專用載(zai)體(ti)。這(zhe)種(zhong)載(zai)體(ti)是(shi)由(you)pBlueScript II SK(+)質(zhi)粒改(gai)建而(er)成(cheng)，和(he)傳(chuan)統T載(zai)體(ti)ECOR V切(qie)開(kai)後加(jia)T方(fang)法(fa)不(bu)同，pSURE-T Simple 通過(guo)改(gai)造pBlueScript II SK(+)，在(zai)原pBlueScript II SK(+)多(duo)克隆位(wei)點引入 Xcm I酶(mei)切(qie)後使(shi)其原多(duo)克隆位(wei)點兩(liang)側的3’末端(duan)直接產(chan)生(sheng)未配(pei)對(dui)的T堿(jian)基，因(yin)此(ci)有更(geng)高的重組效(xiao)率。同時(shi)它(ta)消除了(le)pBlueScript II SK(+)載(zai)體(ti)上的(de)多(duo)克隆酶(mei)切(qie)位(wei)點，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶(mei)切(qie)位(wei)點。此(ci)時(shi)如果使(shi)用PCR擴(kuo)增引物導入的酶(mei)切(qie)位(wei)點進(jin)行DNA酶(mei)切(qie)時(shi)，酶(mei)切(qie)反(fan)應將(jiang)不會(hui)受到T載(zai)體(ti)上其它(ta)多(duo)克隆酶(mei)切(qie)位(wei)點上的(de)限(xian)制(zhi)酶(mei)影響(xiang)，可(ke)以(yi)大大提(ti)高酶(mei)切(qie)效(xiao)率，增(zeng)加(jia)亞(ya)克(ke)隆(long)成(cheng)功率。此(ci)外，本(ben)公司(si)載(zai)體(ti)連(lian)接體(ti)系(xi)還(hai)有(you)背(bei)景低（藍(lan)斑小於10%），重組率高（白(bai)斑中(zhong)超(chao)過90%有(you)插(cha)入片(pian)段(duan)），可(ke)快速(su)連接等(deng)特(te)點。本說(shuo)明書(shu)末列出(chu)了(le)pBLUE-T Simple 載(zai)體(ti)相(xiang)關的技術資(zi)料(liao)，其全序列(lie)可(ke)參照(zhao)pBlueScript II SK(+)序列(lie)，只(zhi)是其多(duo)克隆酶(mei)切(qie)位(wei)點處(chu)序列(lie)稍(shao)有(you)不同。

測(ce)序推(tui)薦(jian)采用M13通(tong)用測(ce)序引物和(he)T3啟動子(zi)引物（見後面圖譜(pu)）
操作步(bu)驟：
1.連接反應的(de)準備(bei)

PCR產(chan)物是(shi)否要進(jin)行純(chun)化取(qu)決於擴增產(chan)物的(de)質量。如果PCR產(chan)物非常幹凈(jing)，不經純(chun)化就(jiu)可(ke)直接進(jin)行連接反應。但(dan)如果是以(yi)質粒為(wei)模板(ban)的(de)PCR產(chan)物則必(bi)須進(jin)行純(chun)化，模板(ban)質(zhi)粒有(you)可(ke)能也形成(cheng)白(bai)斑。PCR產(chan)物可(ke)以(yi)通過(guo)瓊(qiong)脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)分(fen)離(li)。本(ben)公(gong)司(si)生(sheng)產(chan)的DNA產(chan)物快(kuai)速(su)純(chun)化回收(shou)試劑盒(he)對(dui)70bp以(yi)上的(de)DNA片(pian)段(duan)能很(hen)好(hao)地進(jin)行回收(shou)。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚(ju)合酶(mei)擴增(zeng)的(de)PCR產(chan)物，其末端(duan)都帶(dai)有(you)壹個(ge)突出(chu)的3’ -A。 具有(you)3’ -A末端(duan)的PCR產(chan)物可(ke)以(yi)直接用pBLUE-T Simple 載(zai)體(ti)進(jin)行克隆(long)連(lian)接。具有(you)3’®5’外(wai)切(qie)酶(mei)活性(xing)的(de)DNA聚(ju)合酶(mei)（高保真酶(mei)）擴增(zeng)的(de)PCR產(chan)物是(shi)平(ping)末端(duan)，要對(dui)這種(zhong)平(ping)末端(duan)PCR產(chan)物進(jin)行克隆(long)，應優(you)良行(xing)3’­-端(duan)加(jia)A工作。

2.    常規連(lian)接反應：

1)   在(zai)壹(yi)個(ge)標(biao)準的(de)10 ml連(lian)接反應體(ti)系(xi)中(zhong)，加(jia)入1 ml 30ng pBLUE-T Simple載(zai)體(ti)、X ml PCR產(chan)物(在(zai)通常狀況(kuang)下，沒有(you)必(bi)要對(dui)PCR產(chan)物進(jin)行精確定量，壹般(ban)PCR產(chan)物與載(zai)體(ti)的(de)摩(mo)爾(er)比優(you)化至2:1~10:1就(jiu)可(ke)以(yi)得到良好(hao)結果(guo)，推(tui)薦(jian)3:1)、1ml 10´ligation Buffer和(he)0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的(de)T4 DNA Ligase，其余用水(shui)補足(zu)。反(fan)應按(an)以(yi)下體(ti)系(xi)進(jin)行：

壹(yi)般(ban)最後加(jia)入T4 DNA Ligase。

2)   16℃連(lian)接過夜（壹(yi)般(ban)可(ke)在PCR儀(yi)器完成(cheng)）。

通(tong)常推(tui)薦(jian)16℃連(lian)接過夜（10ml體(ti)系(xi)標(biao)準連(lian)接酶(mei)量為2.5 Weiss Units即(ji)可(ke)），可(ke)以(yi)得到最多(duo)的轉化子。但(dan)是本(ben)系統含PEG Enhancer可(ke)以(yi)提(ti)高連接效(xiao)率數(shu)倍(bei)，在高連接酶(mei)量的情況(kuang)下（10ml體(ti)系(xi)推(tui)薦(jian)連(lian)接酶(mei)量為5 Weiss Units）16℃連(lian)接30分(fen)鐘(zhong)即(ji)可(ke)達壹般(ban)研究(jiu)的要求。

3)   冰(bing)上冷(leng)卻(que)，然後轉化或貯存於-20℃。

3. 快(kuai)速(su)連接反應：

1)   反(fan)應按(an)以(yi)下體(ti)系(xi)進(jin)行：

壹(yi)般(ban)最後加(jia)入T4 DNA Ligase。

2)   22℃連(lian)接5-10分(fen)鐘(zhong)（壹(yi)般(ban)可(ke)在PCR儀(yi)器完成(cheng)）。

2 ´Quick Ligation Buffer已(yi)經包含(han)所有優(you)化的快速(su)連接成(cheng)份，通常推(tui)薦(jian)22℃連(lian)接10分(fen)鐘(zhong)（10ml體(ti)系(xi)連(lian)接酶(mei)量為5 Weiss Units，長片(pian)段(duan)連接可(ke)以(yi)延(yan)長至30分(fen)鐘(zhong)）壹(yi)般(ban)可(ke)以(yi)得到滿意(yi)結果(guo)。此(ci)外本(ben)系統也可(ke)在16℃連(lian)接30分(fen)鐘(zhong)（10ml體(ti)系(xi)連(lian)接酶(mei)量為5 Weiss Units）即(ji)可(ke)達壹般(ban)研究(jiu)的要求。

3)   冰(bing)上冷(leng)卻(que)，然後轉化或貯存於-20℃。

4.   轉化：

ð 50-100ml感受態(tai)細胞，置於冰(bing)上，完(wan)quan解(jie)凍(dong)後輕(qing)撣(dan)幾次(ci)將(jiang)細胞均(jun)勻(yun)懸浮。

ð 加(jia)入4－5ml連(lian)接液(最多(duo)可(ke)全部加(jia)入，只(zhi)要體(ti)積(ji)不(bu)超(chao)過(guo)感受態(tai)細胞體(ti)積(ji)的(de)1/10)，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(yun)。冰(bing)上放(fang)置30分(fen)鐘(zhong)。42℃水(shui)浴熱激(ji)90秒。冰(bing)上放(fang)置2~3分(fen)鐘(zhong)。

ð 加(jia)500ml LB或(huo)者(zhe)SOC培(pei)養(yang)基(ji)(不含(han)抗生(sheng)素)，37℃ 150 rpm振蕩培(pei)養(yang)60分(fen)鐘(zhong)。

ð  將(jiang)200ml細菌塗(tu)布(bu)在預先用16ml 50mg/ml IPTG和(he)40ml 20 mg/ml X-gal 塗(tu)布(bu)的(de)氨(an)芐qieng黴(mei)素平(ping)板(ban)上。

塗(tu)布(bu)細菌的(de)用量依連(lian)接的效(xiao)率及(ji)感受態(tai)細胞的(de)感受率而(er)進(jin)行適當(dang)的調整，如果 預計的克隆較(jiao)少，可(ke)通過(guo)離(li)心(xin)（4,000rpm，2 分(fen)鐘(zhong)）後吸(xi)除(chu)部分(fen)培(pei)養(yang)液，留(liu)下適量的培(pei)養(yang)基(ji)懸浮菌體(ti)後取(qu)全(quan)部或者(zhe)適量塗布(bu)於壹個(ge)平(ping)板(ban)中(zhong)（塗布剩余(yu)的菌液可(ke)以(yi)擱在(zai)4度保存，第(di)2天如果轉化菌落數量少，可(ke)將(jiang)剩余(yu)菌液全(quan)部塗壹(yi)個(ge)新(xin)培養(yang)板(ban))。

ð  平(ping)板(ban)在(zai)37℃下正向放(fang)置1小時(shi)以(yi)吸收(shou)過(guo)多(duo)的液體(ti)，然後倒置培(pei)養(yang)過(guo)夜。

5     篩(shai)選(xuan)：

1). 轉化子的藍(lan)白(bai)篩(shai)選(xuan)：

當(dang)外源DNA片(pian)段(duan)插(cha)入到pBLUE-T Simple 中後，由(you)於外源DNA的(de)核(he)酸序列(lie)存在(zai)改(gai)變了(le)LacZ基因(yin)的(de)編(bian)碼，從(cong)而(er)影響(xiang)了(le)其產(chan)物b-半(ban)乳糖(tang)苷酶(mei)a-片(pian)段(duan)的活(huo)性(xing)，因(yin)此(ci)重組克(ke)隆在(zai)X-gal/IPTG平(ping)板(ban)上呈(cheng)現(xian)為(wei)白(bai)色，而(er)非重組克(ke)隆呈(cheng)藍(lan)色(se)。有的時(shi)候(hou)插(cha)入片(pian)段(duan)沒有(you)影響(xiang)lacZ 基(ji)因(yin)讀(du)碼框(kuang)， 或(huo)插(cha)入片(pian)段(duan)太(tai)小，這(zhe)種(zhong)情況(kuang)下菌落（重組克(ke)隆）呈(cheng)現(xian)淡(dan)藍(lan)色(se)或者在(zai)菌落中心(xin)呈(cheng)現(xian)淡(dan)藍(lan)斑點，外圈白(bai)色（魚(yu)眼(yan)狀(zhuang)藍(lan)斑fish eye）。選(xuan)擇(ze)在IPTG/X-gal平(ping)板(ban)上生(sheng)長的白(bai)色菌(jun)落或者(zhe)淡(dan)藍(lan)色(se)菌落，用牙(ya)簽挑(tiao)至(zhi)含氨芐qieng黴(mei)素的(de)液體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)，37℃培養(yang)過(guo)夜。

2).  轉化子的鑒(jian)定：

a.     用上述(shu)培(pei)養(yang)的(de)白(bai)色菌(jun)落的菌(jun)液抽提(ti)質(zhi)粒，用插(cha)入片(pian)段(duan)所帶(dai)酶(mei)切(qie)位(wei)點酶(mei)切(qie)，瓊(qiong)脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)檢(jian)查片(pian)段(duan)大小，確定是否(fou)含有(you)目的片(pian)段(duan)。

b.     挑(tiao)取(qu)白(bai)色菌(jun)落直接進(jin)行PCR檢測(ce)

c.     用T3啟動子(zi)引物或M13通用測(ce)序引物測(ce)序來確定是否(fou)含有(you)目的克(ke)隆(long)。

ð 如何計算連接反應中(zhong)需要的PCR產(chan)物的(de)量?

壹(yi)般(ban)PCR產(chan)物與載(zai)體(ti)的(de)摩(mo)爾(er)比優(you)化至2:1~10:1（推(tui)薦(jian)3:1）就(jiu)可(ke)以(yi)得到良好(hao)結果(guo)，可(ke)采用以(yi)下公式：

[加(jia)入載(zai)體(ti)的(de)量（ng）×插(cha)入片(pian)段(duan)大小（kb）÷載(zai)體(ti)大小（kb）]×插(cha)入片(pian)段(duan)和(he)載(zai)體(ti)的(de)摩(mo)爾(er)比=插(cha)入片(pian)段(duan)的量（ng） 例(li)如：插(cha)入片(pian)段(duan)和(he)載(zai)體(ti)連(lian)接的摩爾(er)比例(li)為(wei)3:1，如連接反應中(zhong)加(jia)入載(zai)體(ti)40ng，插(cha)入片(pian)段(duan)大小為(wei)1000bp，這(zhe)時(shi)應加(jia)入插(cha)入片(pian)段(duan)的量為[40ng載(zai)體(ti)×1kb插(cha)入片(pian)段(duan)÷2.928kb載(zai)體(ti)]×3/1=40.1ng。 

Simple載(zai)體(ti)快(kuai)速(su)克隆(long)試劑盒(he) T4原(yuan)理載(zai)體(ti)