NEB無縫(feng)克隆 --同(tong)源(yuan)重(zhong)組(zu)Gibson組(zu)裝、Golden Gate 組(zu)裝

NEB無縫(feng)克隆(long)

--同(tong)源(yuan)重(zhong)組(zu)Gibson組(zu)裝、Golden Gate 組(zu)裝

北(bei)京(jing)雲(yun)肽生物科技(ji)的(de)美(mei)國(guo)進口(kou)NEB無縫(feng)克隆產(chan)品(pin)，提(ti)供基於(yu)同(tong)源(yuan)重(zhong)組(zu)Gibson組(zu)裝(吉布森組(zu)裝)的(de)NEBuilder高保(bao)真(zhen)無縫(feng)克隆試劑(ji)盒(he)(含核酸外(wai)切酶(mei)、DNA聚合(he)酶、DNA連(lian)接(jie)酶(mei))，以及(ji)基於(yu)Golden Gate 組(zu)裝(金(jin)門(men)組(zu)裝)的(de)NEBridge無縫(feng)克隆試劑(ji)盒(he)(BsaI-HFv2、BsmBI-v2)、50種llS型限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶、T4 DNA連核酶(mei)等(deng)，支(zhi)持≤52個(ge)片(pian)段的(de)無縫(feng)組(zu)裝，具備高組(zu)裝效率、高靈(ling)活性(xing)，支(zhi)持復(fu)雜(za)DNA片(pian)段克隆(long)，為(wei)生物實(shi)驗分(fen)子克(ke)隆(long)提(ti)供高性(xing)能的(de)研(yan)究(jiu)工(gong)具。

壹、NEBuilder Gibson組(zu)裝

NEBuilder無縫(feng)克隆技(ji)術(shu)，是(shi)對同(tong)源(yuan)重(zhong)組(zu)技(ji)術(shu)(即(ji)Gibson組(zu)裝、吉布森組(zu)裝)的(de)升(sheng)級(ji)，在待(dai)插(cha)入片(pian)段末(mo)端(duan)通過PCR擴增添加(jia)15~30bp重(zhong)疊序(xu)列，在等(deng)溫(wen)條件下(xia)，通(tong)過5'外(wai)切酶(mei)消(xiao)化形(xing)成3’突出(chu)粘(zhan)性(xing)末(mo)端(duan)，同(tong)源(yuan)重(zhong)組(zu)互補退火，高保(bao)真(zhen)DNA聚(ju)合(he)酶進行(xing)延伸(shen)，高保(bao)真(zhen)DNA連(lian)接(jie)酶補平缺(que)口(kou)，可(ke)實(shi)現≤11個(ge)片(pian)段的(de)高效(xiao)無縫(feng)組(zu)裝，特(te)別適(shi)合(he)單鏈寡核苷酸ssOligo塔(ta)橋、文庫構建(jian)、微型高通(tong)量克隆(long)等(deng)應(ying)用(yong)。

NEBuilder擁(yong)有>10年的(de)開(kai)發應(ying)用(yong)經驗，性(xing)能指標(biao)嚴格(ge)，保(bao)證(zheng)數(shu)據實(shi)現，具(ju)備高組(zu)裝效率、高保(bao)真(zhen)度(du)，即(ji)可解(jie)決(jue)復雜(za)的(de)gao端(duan)克隆應(ying)用(yong)，也(ye)可(ke)節省(sheng)常規(gui)克隆後(hou)續篩選時(shi)間。

1、不(bu)依賴(lai)內切(qie)酶--只(zhi)需在多(duo)個(ge)片(pian)段末(mo)端(duan)添加(jia)重(zhong)疊序(xu)列，僅(jin)質粒(li)載(zai)體線性(xing)化(hua)時(shi)需要(yao)酶切(qie)，不受限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶所(suo)限，具(ju)備更大靈(ling)活性(xing)。

2、高組(zu)裝效率--支(zhi)持≤11個(ge)片(pian)段的(de)無縫(feng)組(zu)裝。

3、高保(bao)真(zhen)度(du)--使(shi)用(yong)高保(bao)真(zhen)DNA聚(ju)合(he)酶，即(ji)使5'末(mo)端(duan)、3'末(mo)端(duan)存(cun)在錯(cuo)配，高保(bao)真(zhen)DNA聚(ju)合(he)酶可(ke)在退(tui)火後(hou)切割(ge)去除(chu)錯(cuo)配序(xu)列(<10nt)，組(zu)裝正確性(xing)高，無需反(fan)復(fu)篩選、測(ce)序(xu)。

4、兼容性(xing)強(qiang)--支(zhi)持<100bp片(pian)段、>10kb片(pian)段、低(di)起(qi)始量組(zu)裝，可使用(yong)合(he)成的(de)單鏈寡核苷酸ss0ligo連接2條雙(shuang)鏈片(pian)段(如插(cha)入接頭(tou)、gRNA文庫)。

5、方(fang)便(bian)快(kuai)速(su)--只(zhi)需15min、在同(tong)壹管中(zhong)即(ji)可完(wan)成(cheng)無縫(feng)克隆。

6、設(she)計工(gong)具--提(ti)供在線設計軟(ruan)件，可(ke)以方(fang)便(bian)、快(kuai)捷(jie)地進行(xing)NEBuilder組(zu)裝引(yin)物設計，以獲(huo)得(de)高效(xiao)率、高正確性(xing)的(de)無縫(feng)組(zu)裝。

二(er)、NEBridge Golden Gate 組(zu)裝

用(yong)於(yu)無縫(feng)克隆的(de)Golden Gate組(zu)裝技(ji)術(shu)(金(jin)門(men)組(zu)裝技(ji)術(shu))，在dSDNA片(pian)段兩(liang)端(duan)通過PCR擴增添加(jia)IIS型限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶識別位點，經IIS內切(qie)酶酶切(qie)後(hou)，識別位點被(bei)移(yi)除(chu)，形(xing)成互補的(de)4堿基突(tu)出末(mo)端(duan)，再使用(yong)T4 DNA連接(jie)酶進行(xing)連(lian)接，可將(jiang)多個(ge)DNA片(pian)段插入載體(ti)中，實(shi)現兩(liang)個片(pian)段

、或(huo)多個(ge)片(pian)段的(de)克(ke)隆(long)，且(qie)克(ke)隆(long)後(hou)無額外(wai)堿基的(de)插(cha)入。

NEBridpe Golden Gate組(zu)裝試劑(ji)，對傳統技(ji)術(shu)進行(xing)升(sheng)級(ji)，成(cheng)功(gong)實(shi)現≤52個(ge)片(pian)段的(de)高效(xiao)組(zu)裝，提(ti)供包(bao)括成品(pin)Golden Gate 試劑(ji)盒(he)、50種IIS型限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶、連接(jie)酶預混(hun)液(ye)(添(tian)加(jia)了連(lian)接(jie)增強(qiang)劑(ji))、經典(dian)T4 DNA 連接酶等(deng)產(chan)品(pin)，幫(bang)助(zhu)研(yan)究(jiu)者快速(su)構建(jian)重(zhong)組(zu)質粒(li)。

以IIS型限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶BSaI-HFv2為(wei)例，進行(xing)Golden Gate 組(zu)裝時(shi)，需要(yao)在dsDNA片(pian)段的(de)兩(liang)端(duan)加(jia)上其識別位點(GGTCTC)。酶(mei)切(qie)後(hou)，識別位點被(bei)移(yi)除(chu)，組(zu)裝片(pian)段末(mo)端(duan)帶(dai)有設計好(hao)的(de)特(te)定(ding)4堿基突(tu)出以指導(dao)組(zu)裝。

1、高組(zu)裝效率--支(zhi)持≤52個(ge)片(pian)段的(de)高效(xiao)組(zu)裝，具備非常高的(de)組(zu)裝效率和組(zu)裝準確率(lv)，其中<30個(ge)片(pian)段的(de)組(zu)裝效果(guo)更(geng)佳。

2、豐富IIS型內切(qie)酶--NEB提(ti)供業(ye)內更(geng)多的(de)50種(zhong)IIS型限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶，其中9種(zhong)酶經過Golden Gate 組(zu)裝驗證，提(ti)供了(le)更(geng)多酶(mei)切位點選擇(ze)，

3、高兼容性(xing)--支(zhi)持高GC含(han)量、高重(zhong)復序(xu)列、<100bp片(pian)段、>15kb片(pian)段的(de)復(fu)雜(za)組(zu)裝。

4、高保(bao)真(zhen)度(du)--NEB經典(dian)T4連接酶，通(tong)過高保(bao)真(zhen)末(mo)端(duan)連接，提(ti)高復(fu)雜(za)多(duo)片(pian)段組(zu)裝的(de)正確性(xing)(20個(ge)片(pian)段組(zu)裝正確率(lv)>90%);升級(ji)的(de)NEBridge連(lian)接(jie)酶(mei)預混(hun)液(ye)，對緩沖(chong)液(ye)體(ti)系、操(cao)作(zuo)步驟進行(xing)優(you)化，搭配NEB IIS型內切(qie)酶使用(yong)，可進壹步(bu)提(ti)高連(lian)接效率(lv)和保(bao)真(zhen)度(du)。

圖(tu).使用(yong)NEBridge連接(jie)酶預混(hun)液(ye)進行(xing)24個(ge)片(pian)段的(de)Golden Gate 組(zu)裝。使用(yong)NEBridge連接(jie)酶預混(hun)液(ye)時(shi)，每(mei)微克載體DNA產(chan)生2.2±0.2*10⁶個(ge)正確組(zu)裝的(de)菌(jun)落(luo)，保(bao)真(zhen)度(du)為(wei)94.3±1%，而使用(yong)NEB T4 DNA連接(jie)酶緩沖(chong)液(ye)時(shi)，每(mei)微克載體DNA產(chan)生8.3±2.1*10⁵個(ge)正確組(zu)裝的(de)菌(jun)落(luo)，保(bao)真(zhen)度(du)為(wei)69.8士(shi)10.7%。

5、使(shi)用(yong)靈(ling)活--提(ti)供Golden Gate組(zu)裝試劑(ji)盒(he)(Bsa1-HFv2、BsmBI-v2)、50種llS型限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶、NEBridge連接(jie)酶預混(hun)液(ye)、T4 DNA連(lian)接(jie)酶(mei)等(deng)豐富產(chan)品(pin)形(xing)式(shi)，供實(shi)驗人員靈(ling)活使用(yong)。

6、操(cao)作簡單--酶(mei)切和連接反應(ying)可在同(tong)壹管中(zhong)完(wan)成(cheng)，簡化(hua)實(shi)驗步驟。

7、

DNA組(zu)裝選擇(ze)

北(bei)京(jing)雲(yun)肽生物科技(ji)