酸性(xing)固(gu)綠染(ran)色(se)液(ye)的常見問(wen)題(ti)排(pai)查(zha)指(zhi)南

　　在組(zu)織(zhi)學與(yu)病(bing)理(li)學研究(jiu)中(zhong)，酸性(xing)固(gu)綠染(ran)色(se)液(ye)法(fa)因(yin)其對(dui)膠原纖維(wei)的獨特親和(he)力(li)而(er)被(bei)廣(guang)泛應(ying)用(yong)。然而(er)，實(shi)驗(yan)過(guo)程(cheng)中(zhong)常出現(xian)染(ran)料(liao)沈澱(dian)或(huo)染(ran)色(se)不(bu)均勻(yun)的(de)現(xian)象(xiang)，嚴重(zhong)影響(xiang)切片(pian)質量和(he)結(jie)果(guo)判(pan)讀(du)。本(ben)文(wen)將(jiang)從溶液配制、操(cao)作(zuo)流(liu)程和(he)故障(zhang)排(pai)除三(san)個(ge)方面系(xi)統解(jie)析問(wen)題(ti)成因(yin)及解決方案。
 

　　壹、染(ran)料(liao)沈澱(dian)的(de)根(gen)源與預(yu)防(fang)
 

　　酸(suan)性(xing)固(gu)綠染(ran)色(se)液(ye)穩(wen)定性(xing)差是(shi)導(dao)致沈澱(dian)的(de)主(zhu)要(yao)原因(yin)。其本(ben)質(zhi)源(yuan)於(yu)染(ran)料(liao)分子(zi)在低離(li)子(zi)強(qiang)度(du)環(huan)境下(xia)的(de)聚(ju)集傾(qing)向。建(jian)議采用(yong)分級溶解(jie)法(fa)：先(xian)將少(shao)量冰(bing)醋(cu)酸(suan)加入(ru)蒸餾(liu)水(shui)中(zhong)形成緩(huan)沖(chong)體(ti)系(xi)，再(zai)緩(huan)慢撒入(ru)固(gu)綠粉(fen)末(mo)並持(chi)續攪拌30分鐘以(yi)上(shang)。配制完成的(de)染(ran)液(ye)應靜置過(guo)夜後(hou)過(guo)濾(lv)使(shi)用(yong)，去除未(wei)溶解(jie)顆(ke)粒(li)。儲存(cun)時(shi)應避(bi)免陽(yang)光直(zhi)射(she)，選(xuan)用(yong)棕色(se)避(bi)光瓶(ping)並放(fang)置於(yu)陰涼處，定期(qi)觀(guan)察(cha)是(shi)否(fou)有(you)結(jie)晶(jing)析出。若(ruo)出現(xian)輕(qing)微渾濁，可添(tian)加(jia)適量甲醇改(gai)善溶(rong)解度(du)；嚴重(zhong)沈(chen)澱(dian)則(ze)需重(zhong)新配制新鮮染(ran)液(ye)。
 

　　二、染(ran)色(se)不(bu)均的(de)技(ji)術(shu)要(yao)點控制
 

　　組織(zhi)預處理(li)不(bu)當會(hui)造(zao)成著(zhe)色(se)差異。固(gu)定時(shi)間不(bu)足(zu)會(hui)導(dao)致細胞(bao)脫落，過度固(gu)定又會(hui)使(shi)基(ji)質硬化(hua)阻(zu)礙染(ran)料(liao)滲(shen)透(tou)。標(biao)準操(cao)作(zuo)流(liu)程要(yao)求10%中(zhong)性(xing)福(fu)爾(er)馬(ma)林(lin)固(gu)定6-8小時(shi)，流水(shui)沖(chong)洗梯(ti)度(du)酒(jiu)精(jing)脫水(shui)至(zhi)95%濃(nong)度(du)保存(cun)。脫水(shui)不完會(hui)引(yin)起水(shui)油界面殘留(liu)水(shui)分，影響(xiang)二(er)甲苯透(tou)明效(xiao)果。浸(jin)蠟溫(wen)度(du)控(kong)制在62℃左右為(wei)宜，過(guo)高易(yi)造(zao)成組織(zhi)收(shou)縮變形。切片(pian)厚度(du)均勻(yun)性(xing)同(tong)樣(yang)關鍵(jian)，推(tui)薦使用(yong)振(zhen)動切片(pian)機獲(huo)得連續薄片(pian)(3-5μm)，厚薄不(bu)壹會(hui)導(dao)致染(ran)色(se)深(shen)淺(qian)交(jiao)錯(cuo)。
 

　　染(ran)色(se)步驟的(de)時(shi)間把(ba)控決定成敗。從(cong)低(di)濃(nong)度(du)起始逐步遞(di)增(zeng)濃(nong)度(du)梯(ti)度染(ran)色(se)法(fa)能有(you)效(xiao)避免背景(jing)過(guo)染(ran)。初(chu)次染(ran)色(se)時(shi)間控(kong)制在5-10分鐘，鏡下(xia)觀(guan)察(cha)調(tiao)整(zheng)後(hou)續復染(ran)時(shi)長(chang)。分化(hua)步驟使(shi)用(yong)弱酸性(xing)酒(jiu)精(jing)(pH值(zhi)約4.5)進(jin)行(xing)快速漂(piao)洗，既(ji)能(neng)去除多余(yu)染(ran)料(liao)又能(neng)保留(liu)陽(yang)性(xing)信(xin)號。需要(yao)註意(yi)的是(shi)，不(bu)同(tong)批次購置的(de)染(ran)料(liao)批號差異可能導(dao)致(zhi)顯色(se)強(qiang)度波(bo)動(dong)，建(jian)立(li)標(biao)準化曲線(xian)至(zhi)關重(zhong)要(yao)。
 

　　三(san)、系(xi)統性(xing)故障(zhang)診斷(duan)方案
 

　　建(jian)立(li)對照(zhao)實(shi)驗(yan)快(kuai)速(su)定位問(wen)題(ti)環(huan)節(jie)：取同(tong)壹(yi)蠟塊連續切片(pian)分別進(jin)行(xing)HE常規(gui)染(ran)色(se)和(he)特(te)殊染(ran)色(se)對(dui)比，確(que)認(ren)是(shi)否(fou)為染(ran)色(se)體(ti)系(xi)特(te)異性(xing)問(wen)題(ti)。設(she)置陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)(已(yi)知(zhi)含豐富膠原的(de)組(zu)織(zhi)如肌(ji)腱)和(he)陰性(xing)對(dui)照(zhao)(單(dan)純上(shang)皮組(zu)織(zhi))，驗(yan)證試劑活性(xing)。若(ruo)所有(you)切片(pian)均出現(xian)類似(si)異常，則(ze)需追(zhui)溯(su)至(zhi)染(ran)液(ye)配制環(huan)節(jie)；個(ge)別樣(yang)本(ben)異常則(ze)重(zhong)點檢(jian)查(zha)該組織(zhi)的前(qian)處理(li)過(guo)程(cheng)。定期(qi)校準pH計(ji)確(que)保緩(huan)沖(chong)體(ti)系(xi)穩(wen)定，每月更換新鮮染(ran)液(ye)防(fang)止(zhi)效(xiao)能衰(shuai)減。對於(yu)頑固(gu)性(xing)沈(chen)澱(dian)問(wen)題(ti)，可嘗(chang)試(shi)添(tian)加(jia)0.1%吐溫(wen)-20作(zuo)為(wei)分散(san)劑，但需預先(xian)測(ce)試(shi)對(dui)組織(zhi)結(jie)構的(de)影響(xiang)。
 

　　從(cong)本質(zhi)上(shang)看，酸(suan)性(xing)固(gu)綠染(ran)色(se)液(ye)的質(zhi)量取決於(yu)精(jing)細(xi)化(hua)的操(cao)作(zuo)控(kong)制與嚴格的質(zhi)控管理(li)。通過規範溶液(ye)配(pei)制程序、優化組(zu)織(zhi)處理(li)方法(fa)和(he)建(jian)立(li)標(biao)準化操(cao)作(zuo)流(liu)程，實(shi)驗(yan)室(shi)可將染(ran)色(se)合(he)格率提(ti)升至(zhi)95%以(yi)上(shang)。隨著(zhe)數字(zi)病理(li)圖(tu)像(xiang)分析技術(shu)的發(fa)展(zhan)，量化評估(gu)染(ran)色(se)強(qiang)度已(yi)成(cheng)為(wei)可能。建(jian)議實(shi)驗(yan)室(shi)建(jian)立(li)歷史(shi)數(shu)據庫(ku)記錄(lu)每次染(ran)色(se)參(can)數與(yu)成(cheng)像(xiang)效(xiao)果的(de)關系(xi)，運(yun)用(yong)機器學習算(suan)法(fa)預測(ce)較(jiao)佳染(ran)色(se)條件(jian)。畢(bi)竟，在科研探索中(zhong)，每壹(yi)個(ge)清(qing)晰的細(xi)胞輪(lun)廓都是(shi)揭(jie)示生命(ming)奧(ao)秘的(de)起點。